Electroforesis

ELECTROFORESIS
Técnica para la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico.
* La electroforesis puede realizarse de 3 maneras:
* Sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (ej: electroforesis en papel o en acetato de celulosa)
* A través de una matriz porosa (ej: electroforesis en gel)
* En disolución (electroforesis libre)
* Lavariante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida.
* Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una maneradependiente de la masa molecular de la proteína.
* Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.
* PROCESO DE ELECTROFORESISEN GEL
El proceso comienza colocando una muestra en el extremo del gel con un tampón adecuado. Se hace pasar la corriente eléctrica a través del gel, de manera que las moléculas migran según la carga, además de que también migran según el tamaño del poro, separándose las moléculas también por tamaño debido a la fricción.
* Tenemos pues 2 tubos:
-Tubo 1: 2 microlitros de ARNm + 6microlitros de agua DEPC
-Tubo 2: 8 microlitros de sobrenadante
* A cada uno de los tubos vamos a añadir 2microlitros de buffer, que es una solución que da densidad a las muestras para que no difundan en el gel de electroforesis.
* El gel de electroforesis lo hacemos con agarosa 1% en TAE 1x con 1 microlitro de bromuro de etidio (10mg/ml) por cada 20ml de gel que queramos preparar. El bromuro deetidio se utiliza porque tiene afinidad a los ácidos nucleicos, y además tiene la característica de que es visible con la luz ultravioleta, de manera que una vez corrido el gel, podemos observar las bandas donde hay ácidos nucleicos con la ayuda de la luz ultravioleta.
Ponemos a correr el gel.
* Al final del proceso, si hemos hecho bien la obtención del ARNm y la electroforesis, al iluminar conluz UV deberíamos ver una banda casi al final del gel, que correspondería a ARN ribosómico que pudieron purificar junto con el ARNm, y que es más pequeño, por lo que corre más. Luego, en la parte superior a la banda de ARNr, aparece una mancha que recorre casi todo el camino del corrimiento, y corresponde al ARNm, que se presenta en distintos tamaños, por lo que no vemos una sola banda.

*PROCESO DE ELECTROFORESIS EN PAPEL
* La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro humedecido con una 2 disoluciones tampón, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel , dependiendo de las sustancias a separar y del pH del tampón. Los extremos de la tira se sumergen en dos recipientes separados que contienen la disolución tampón y en los que se hallan colocados loselectrodos.
* Se conectan los electrodos a una fuente de tensión continua y se aplica una diferencia de potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente directa, las moléculas cargadas de la mezcla emigran hacia los electrodos de polaridad opuesta formando bandas en el papel . La velocidad de emigración de una molécula, depende preferentemente de su carga.
Aplicaciones
*Electroforesis en Papel; Se emplea en la separación de sustancias de bajo peso molecular como aminoácidos y péptidos.
* Pueden hacerse en tiras de acetato de Celulosa, Que son químicamente más homogéneas y son transparentes.
* El acetato de celulosa se utiliza también para separar lipoproteínas
* Electroforesis en gel; Puede ser una técnica preparativa para purificar moléculas antes de...