Electroforesis

Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 40, No. 2, 2009.

COMUNICACIÓN CORTA

Preparación semi–noenzimática del ADN
de Streptococcus pyogenes y separación
de los macrofragmentos de restricción con SmaI mediante
Electroforesis de Campos Pulsantes en minigeles
Yaumara López-Carballo, Yainelis Garrido Nicot, Esperanza Niubó, Nelson Diaz, Ana M. Riverón
y Lilia López-Canovas.
Departamentode Biología Molecular, Centro de Neurociencias de Cuba, Apartado Postal 6412, Ciudad de La Habana,
Cuba. Correo electrónico: llc@cneuro.edu.cu

Recibido: 26 de enero de 2008.

Aceptado: 2 de septiembre de 2008.

Palabras clave: Electroforesis de Campos pulsantes en minigeles, Streptococcus pyogenes, ADN intacto e inmovilizado, tipificación molecular.
Key words: miniPFGE, Streptococcuspyogenes, immobilized intact DNA, molecular subtyping.

Los métodos de subtipación molecular de microorganismos son la base de los programas de vigilancia
epidemiológica actuales.1 Ellos permiten identificar los
subtipos moleculares de los microorganismos patógenos,
lo cual facilita su control y la toma de medidas para evitar
su diseminación. La Electroforesis de Campos Pulsantes
(ECP)constituye el estándar de oro para la subtipacion
molecular bacteriana porque permite analizar el genoma
completo de las bacterias en un único experimento.2
Mediante la ECP es posible separar en forma de un
patrón de bandas los macrofragmentos de restricción
del ADN genómico de las bacterias. La comparación
de los patrones de bandas de diferentes aislados de
una misma especie permite determinar lasdiferencias
genéticas entre ellos y clasificarlos en subtipos.3 Streptococcus pyogenes beta hemolítico del grupo A (BHGA)
es un patógeno humano de interés epidemiológico que
es tipificado comúnmente por ECP 4 Sin embargo, el
.
requerimiento de disoluciones enzimáticas costosas
para preparar ADN intacto e inmovilizado de este microorganismo, los tiempos prolongados de incubación
en dichasdisoluciones que son necesarios durante
la preparación de las muestras de ADN (2 a 3 d) y los
largos tiempos de electroforesis en los equipos de ECP
convencionales (20 a 24 h)5 para resolver los fragmentos
de ADN digerido con enzimas de restricción, constituyen
limitaciones para que este procedimiento sea utilizado
rutinariamente en los laboratorios de microbiología. El
uso de la minicámaraCHEF (Contour Clamped Homo geneous Electric Field) del equipo Guefast-06 (Neuronic
S.A.), el cual es una versión miniaturizada de los equipos
de ECP en el que se pueden aplicar campos eléctricos
elevados ha permitido reducir los tiempos de electrofo resis6 y obtener en 5 h los cariotipos electroforéticos de

Entamoeba histolytica y Saccharomyces cerevisiae, así
como los patroneselectroforéticos de los macrofragmentos de restricción del ADN de Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli, Vibrio cholerae y Aeromonas spp.7-11
Utilizando dicha minicámara CHEF se desarrolló un pro cedimiento que consume menor tiempo de corrida para
separar los macrofragmentos de restricción del ADN de
cepas de Streptococcus pyogenes. Se propone también
un método semi-noenzimático en el que no se utilizanproteasas para preparar las muestras de ADN intacto e
inmovilizado de dicho microorganismo.
Se inocularon 6 ·1010 unidades formadoras de colonias
(UFC) de Streptococcus pyogenes ATCC 12384 en 100 mL
de medio caldo-cerebro-corazón y se cultivó durante
3 h con agitación de 180 r/min en zaranda provista de
termostato a 37 °C . Las bacterias se colectaron por centrifugación, se decantó elsobrenadante y el sedimento se lavó
con disolución de lavado No.1 del BacKit (Neuronic S.A.). El
sedimento celular fue atemperado a 42 °C y se mezcló
con agarosa de bajo punto de fusión al 1,5 % en diferentes
proporciones, de modo que las concentraciones finales
fueran de 3, 2, ó 1 · 1010 células/mL . Dichas mezclas se
vertieron con la ayuda del set de accesorios del Guefast
-06 (Neuronic...