¿En que medida el adn nos hace diferente ?

BE POSITIVEDurante treinta años la mayor parte de la secuenciación
de ADN se llevó a cabo con el método de terminación de
la cadena desarrollado por Frederick Sanger y colaboradores en 1975.[1]
[2] Antes del desarrollo de métodos rápidos de secuenciación del ADN a principios de
los 70 por Sanger en Inglaterra y Walter Gilbert y Allan Maxam en Harvard,[3] [4]
se utilizaban varios métodosde laboratorio. Por ejemplo,
en 1973[5] Gilbert y Maxam publicaron una secuencia de 24 pares de bases utilizando un método conocido como "de punto corrido" (wandering spot).
Secuenciación de Maxam-GilbertMétodos de terminación de la cadena
Parte de un gel de secuenciación con marcaje radiactivo.Mientras que el método de secuenciación química de Maxam y Gilbert y el método más-menos de Sangery Coulson eran órdenes de magnitud más rápidos que los métodos previos, el método de terminación de la cadena desarrollado por Sanger era incluso más eficiente y rápidamente se convirtió en el método de elección. La Técnica de Maxam-Gilbert requiere el uso de productos químicos altamente tóxicos y grandes cantidades de ADN marcado radiactivamente, mientras que el método de terminación de lacadena utiliza pocos reactivos tóxicos y cantidades menores de radiactividad. El principio clave del método de Sanger es el uso de didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la cadena de ADN.

El método clásico de terminación de la cadena o método de Sanger necesita una hebra molde de ADN de cadena sencilla, un cebador de ADN, una ADN polimerasa con nucleótidos marcadosradiactivamente o mediante fluorescencia y nucleótidos modificados que terminan la elongación de la cadena de ADN. La muestra de ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciación separadas que contienen los cuatro desoxinucleótidos estándar (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) y una ADN polimerasa. En cada reacción se añade solo uno de los cuatro didesoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP). Estosdidesoxinucleótidos terminan la elongación de la cadena al carecer un grupo 3'-OH que se necesita para la formación del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos durante la elongación de la cadena de ADN. La incorporación de un didesoxinucleótido en la cadena naciente de ADN termina su extensión, lo que produce varios fragmentos de ADN de longitud variable. Los didesoxinucleótidos se añaden a concentracioneslo suficientemente bajas como para que produzcan todas las posibilidades de fragmentos y al mismo tiempo sean suficientes para realizar la secuenciación.

Los fragmentos de ADN sintetizados y marcados de nuevo son desnaturalizados por calor y separados por tamaño (con una resolución de un solo nucleótido) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida - urea. Cada una de las cuatro reaccionesde síntesis se corre en carriles individuales (Carril A, T, G y C) y se visualizan las bandas de ADN mediante autoradiografía o luz ultravioleta, y la secuencia de ADN se puede leer directamente a partir de la placa de rayos X o de la imagen del gel. En la imagen de la derecha, la película de rayos-X se expuso directamente al gel de modo que las bandas oscuras corresponden a los fragmentos de ADNde diferentes longitudes. Una banda oscura en un carril indica un fragmento de ADN que es el resultado de una terminación de la cadena tras la incorporación de un didesoxinucleótido (ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP). El nucleótido terminal puede ser identificado de acuerdo al didesoxinucleótido que se añadió en la reacción que dio lugar a esa banda. Las posiciones relativas entre las cuatro callesse utilizan entonces para leer (de abajo a arriba) la secuencia de ADN como se indica.

Otras tecnologías de secuenciaciónOtros métodos de secuenciación por ADN podían tener ventajas en términos de eficiencia o exactitud. Al igual que la secuenciación por terminador marcado por tinción, están limitadas a la secuenciación de fragmentos únicos aislados. La "secuenciación por hibridación" es un...