Enviar a un amigo

Definición de secuenciación de ADN
Es el proceso mediante el cual se determina el orden de nucleótidos de un fragmento dado de ADN, es una técnica propia de la Ingeniería Genética y se ha desarrollado, gracias a las enzimas de restricción y a la posibilidad de obtener numerosas copias de un ácido nucléico por medio de la clonación. Se han desarrollado diferentes métodos para obtener lasecuencia de nucleótidos del ADN, sin embargo, actualmente los métodos más utilizados son el de secuenciación automática y el método enzimático de terminación de cadena de Sanger también conocido por el método didesoxi. La Secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN.Historia de la secuenciación de ADN
Inicialmente, se pensaba que la secuenciación de los ácidos nucleicos
Era mucho más difícil que la de las proteínas, y muy poco progreso se hizo
Hasta 1960. Esto se debió, en parte, a la falta de substratos puros del tamaño
Adecuado.

El primer ácido nucleico en ser secuenciado fue el ARN la de levadura. La secuencia de este nucleótido de 76 bases fuerealizada por Holley y colaboradores en siete años (Stewart y Letham, 1977). Ellos usaron métodos
de secuenciación similares a los que se usaban para secuenciar proteínas.

En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un método para secuenciar ADN basado en la modificación química del ADN. La secuenciación de Maxam y Gilbert rápidamente se hizo más popular hasta que se pudo utilizar ADNdirectamente, con el desarrollo y mejora del método de terminación de la cadena, la secuenciación de Maxam y Gilbert ha quedado en desuso

Poco después, Frederick Sanger, .y sus colaboradores dirigieron sus esfuerzos para desarrollar técnicas de fraccionamiento más rápidas y simples, las cuales permitieron la secuenciación de ARN y luego de ADN. El grupo de Sanger marcó el ARN con 32P, y pudodetectarlo mediante autoradiografías. Además, introdujeron un método más sencillo para fraccionar los oligonucleótidos.

Métodos de secuenciación
Método (Maxam and Gilbert, 1977).

En este método, un fragmento de ADN de cadena doble o sencilla se marca en los extremos 5´ o 3´ de una o ambas hebras con 32P. Después, la muestra de ADN se divide en cuatro alícuotas y se fragmenta en cuatroreacciones químicas distintas. Posteriormente, los fragmentos de ADN generados pueden ser separados por electroforesis en cuatro carriles distintos con base en su tamaño. Conociendo el nucleótido en el que se realizaron los cortes, se puede inferir la secuencia de la molécula original. Las reacciones químicas que se utilizan para fragmentar la molécula de ADN. El tratamiento químico genera rupturas enuna pequeña proporción de uno o dos de los cuatro nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molécula. Los fragmentos posteriormente se separan por tamaño mediante electroforesis en gel, separando los productos de las cuatro reaccionesen cuatro carreras distintas, pero una al lado de la otra. Para visualizar los fragmentos generados en cada reacción, se hace una autoradiografía del mismo, lo que proporciona una imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioisótopo, a partir de las cuales se puede inferir la secuencia.
Tratamiento:
Base especifica | Químico utilizado para alterarla base | Químico utilizado para remover la base | Químico utilizado el desdoblamiento la base |
G | DIMETIL SULFATO | PIPERIDINA | PIPERIDINA |
A+G | ACIDO | ACIDO | PIPERIDINA |
C+T | HIDRACINA | PIPERIDINA | PIPERIDINA |
C | HIDRACINA+ ALKALI | PIPERIDINA | PIPERIDINA |

* Dimetil sulfato: Metila el N7 debilitando el enlace entre C8 y C9 de la Guanina....