Enzimas

PRUEBA DE CATALISIS ENZIMÁTICA
A.- Pruebas de acción enzimática (de la catalasa)
METODOLOGÍA:
Material y equipo
10 tubos de ensaye de 20 mL
2 vasos de precipitados de 100 mL
2 vasos de precipitados de 50 mL
2 Gradilla para tubos
Pinzas para tubos de ensaye
Pipetas serológicas (2 y 5 mL)
Baño maría a 37 ºC
Termómetro
Mechero Bunsen
Plato caliente
Pelador de vegetales
Cuchillo ytabla

* Aparato de medición de oxígeno:
1 o 2 jeringas de 20 mL (perfectamente secas y libres de cualquier sustancia)
1 jeringa de 5 mL
Tapones de hule sin perforaciones (para el tubo de 20 mL)

IV.2. Reactivos y soluciones
80 mL de solución de sangre fresca al 4% en solución isotónica (0.85% NaCl)
80 gotas de solución surfactante al 1%
20 gotas de cianuro de sodio al 5% (veneno!!!)50 mL de peróxido de hidrógeno al 3% (solución comercial del H2O2)
25 mL de peróxido de hidrógeno al 0.3%
Varios vegetales (zanahoria, papa, lechuga, etc.)
Procedimiento

A.1. Procedimiento general: catalasa en tejido (sangre)

Tomar 3 tubos de ensaye de 20 mL y numerarlos
Agregar 3 mL de la solución de sangre al 4% a cada tubo
Agregar 5 gotas de surfactante
Proceder para cada tubocomo se muestra en la cuadro 1

Cuadro 1: Factores que afectan la actividad de una enzima (catalasa)

Tubo | Tratamiento |
1 | Control negativo |
2 | Temperatura: Directo en la flama hasta ebullición, 2 veces (evitar proyecciones) |
3 | Inhibidor: Agregar 5 gotas de cianuro de sodio (veneno!!) |

A los tres tubos agregar lentamente por la pared 2 mL de de H2O2 al 3%; los tubos nodeben mezclarse ni agitarse.
Incubar los tubos en baño maría a 37 ºC por 5 minutos.
Colocar los tubos en la gradilla y anotar los resultados.

2. Determinación de oxígeno (liberado)

Parte 1: Preparación de las diluciones del H2O2 y de la sangre fresca

Numerar los vasos de precipitados y los tubos del 1 al 6
Proceder para cada tubo como se muestra en la tabla 2

Cuadro 2: Preparación desoluciones de H2O2 y de sangre fresca

Tubo/vaso | Soluciones |
1 | 50 mL de H2O2 al 3% |
2 | 10 mL de H2O2 1:1 (5 mL de H2O2 al 3% + 5 mL de agua destilada) |
3 | 10 mL de H2O2 al 0.3% (1 mL de H2O2 al 3% + 9 mL de agua destilada) |
4 | 50 mL de sangre fresca al 4% |
5 | 3 mL de sangre al 4% y calentar a flama directamente hasta ebullición |
6 | 3 mL de sangre al 4% + 5 gotasde cianuro de sodio al 5% |

Parte 2: Determinación del oxígeno (liberado)

En el tubo de ensaye de 20 mL del aparato o tubo A:

Agregar 3 mL del tubo 4 (sangre fresca al 4%).
Agregar 5 gotas de surfactante.
Mezclar golpeando suavemente el tubo.
Tapar perfectamente el tubo con un tapón de hule, ajustar la aguja de la jeringa al tapón.
Añadir 2 mL del tubo 1 (H2O2 al 3%) con la jeringade 5 mL, ajustar la jeringa a la aguja colocada en el aparato y presionar lentamente para dejar caer el contenido.
Cambiar rápidamente la jeringa y ajustar la jeringa de 20 mL en el aparato.
A los 2 minutos de haber agregado el H2O2 anotar la distancia recorrida por el émbolo.
Desmontar, lavar perfectamente, secar el émbolo y la jeringa de 20 mL perfectamente (o usar otra jeringa nueva).
Nota:para el desplazamiento del émbolo, éste debe estar completamente seco para evitar fricciones y pueda desplazarse adecuadamente. En caso de no desplazarse, jalar muy suavemente el émbolo hacia arriba.

Repetir el procedimiento utilizando el H2O2 de los tubos 2 (Tubo B) y 3 (Tubo C) de acuerdo al Cuadro 3.

Realizar lo mismo con la sangre contenida en los tubos 5 (Tubo D) y 6 (Tubo E),añadiendo 2 mL del tubo 1 (H2O2 al 3%) (Cuadro 3).

Agregar en todos los casos 5 gotas de surfactante después de la muestra de sangre y mezclar golpeando suavemente el tubo.

Cuadro 3: Efecto del tratamiento y la concentración del sustrato H2O2 sobre la actividad de la catalasa

Tubo | Solución de sangre | Solución de H2O2 |
A | 3 mL del tubo 4 (sangre al 4%) | 2 mL del tubo 1 (H2O2 al 3%) |...