Epifluorescencia
Páginas: 5 (1126 palabras)
Publicado: 11 de julio de 2014
INTRODUCCIÓN
Las bacterias y otros microorganismos heterotróficos juegan un papel importante en los ecosistemas y tienen una función clave en los flujos de materia orgánica dentro de la red trófica contribuyendo a los componentes del “microbial loop” o circuito microbiano. Dentro de los métodos directos más utilizados está la microscopía de epifluorescencia. El microscopio utilizado en estatécnica es diferente de un microscopio óptico de transmisión en el que se observa solo componentes fluorescentes. En general un componente fluorescente se utiliza para visualizar células protistas que son visualizadas por la estimulación de un flurocromo con alta energía o longitud de onda corta; causando que ésta emita luz de menor energía. En estos microscopios con epifluorescencia la luz queexcita el cromóforo tiene una trayectoria a 180 grados de la luz observado, significa que pasa por el objetivo del microscopio donde se colecta la luz para él. La luz incidente, de excitación, que procede de una fuente potente, atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al flurocoromo antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra (reflejada yfluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión de las moléculas fluorescentes. Las células a observar, se tiñen con colorantes fluorescentes para su visualización.
Los colorantes utilizados producen fluorescencia bajo condiciones específicas, por ejemplo cuando se asocian con componentes celulares como ADN y ARN.
Los fluorocromos absorben la luz de unadeterminada longitud de onda y emiten luz con otra longitud de onda más larga; haciendo que el componente aparezca brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada.
Los colorantes fluorescentes utilizados para la detección de las células mediante ADN y/o ARN incluyen, entre otros; la Naranja de Acridina(3,6-bisdimetilamino) acridina); Hobbie et al. 1977), DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindol; Porter y Feig 1980), Hoechst 33825 (Paul 1982), SYBR Green I, II, Gold (Noble y Fuhrman 1998; Haugland 2002). Entre estos colorantes hay los que son específicamente para el ADN (DAPI) y otros específicos para los dos tipos de ácidos nucleicos (SYBR Green I).
PROCEDIMIENTO
RECUENTO DIRECTO DE BACTERIASAMBIENTALES POR EPIFLUORESCENCIA
Protocolo de trabajo
Se tomó agua de la Columna de Winograsdky utilizando una pipeta Pasteur.
Se tomó 50ul y se colocó en un criovial.
Luego se colocó 2ul de la Solución Stock de Naranja de Acridina. Se mezcló y se dejó reposar en oscuridad por 10minutos.
Finalmente, se observó al microscopio de epifluorescencia.
RESULTADOS
El análisis deimágenes para la enumeración de bacterias acuáticas y acoplada con el microscopio de epifluorescencia se ha convertido en una herramienta cuantitativa.
En la fotografía se observa microoganismos teñidos con naranja de acridina que es un fluorocromo muy permeable que actúa como agente intercalante, interaccionando tanto con DNA como RNA. Su absorción de luz es máxima a 500 nm y emite una fluorescenciade color verde (520 nm).
Los teñidos con verde son aquellos activos en reproducción, mientras que los de color naranja los que están en crecimiento.
DISCUSION DE RESULTADOS
Para evaluar el papel ecológico de las bacterias heterotróficas en un sistema acuatico, el parámetro más básico que puede ser considerado es la biomasa. Con estos valores se puede determinar la actividad potencialpoblacional en el ambiente así como su potencial como fuente alimenticia parar niveles tróficos superiores (Azam et al. 1983; Bratbak 1993).
Sin embargo, una de las limitaciones para poder determinar este valor es que las características de las bacterias no permiten hacer la estimación de la biomasa por los métodos tradicionales ya que son células muy pequeñas, por debajo de 1.2 µm y los...
Las bacterias y otros microorganismos heterotróficos juegan un papel importante en los ecosistemas y tienen una función clave en los flujos de materia orgánica dentro de la red trófica contribuyendo a los componentes del “microbial loop” o circuito microbiano. Dentro de los métodos directos más utilizados está la microscopía de epifluorescencia. El microscopio utilizado en estatécnica es diferente de un microscopio óptico de transmisión en el que se observa solo componentes fluorescentes. En general un componente fluorescente se utiliza para visualizar células protistas que son visualizadas por la estimulación de un flurocromo con alta energía o longitud de onda corta; causando que ésta emita luz de menor energía. En estos microscopios con epifluorescencia la luz queexcita el cromóforo tiene una trayectoria a 180 grados de la luz observado, significa que pasa por el objetivo del microscopio donde se colecta la luz para él. La luz incidente, de excitación, que procede de una fuente potente, atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al flurocoromo antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra (reflejada yfluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión de las moléculas fluorescentes. Las células a observar, se tiñen con colorantes fluorescentes para su visualización.
Los colorantes utilizados producen fluorescencia bajo condiciones específicas, por ejemplo cuando se asocian con componentes celulares como ADN y ARN.
Los fluorocromos absorben la luz de unadeterminada longitud de onda y emiten luz con otra longitud de onda más larga; haciendo que el componente aparezca brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada.
Los colorantes fluorescentes utilizados para la detección de las células mediante ADN y/o ARN incluyen, entre otros; la Naranja de Acridina(3,6-bisdimetilamino) acridina); Hobbie et al. 1977), DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindol; Porter y Feig 1980), Hoechst 33825 (Paul 1982), SYBR Green I, II, Gold (Noble y Fuhrman 1998; Haugland 2002). Entre estos colorantes hay los que son específicamente para el ADN (DAPI) y otros específicos para los dos tipos de ácidos nucleicos (SYBR Green I).
PROCEDIMIENTO
RECUENTO DIRECTO DE BACTERIASAMBIENTALES POR EPIFLUORESCENCIA
Protocolo de trabajo
Se tomó agua de la Columna de Winograsdky utilizando una pipeta Pasteur.
Se tomó 50ul y se colocó en un criovial.
Luego se colocó 2ul de la Solución Stock de Naranja de Acridina. Se mezcló y se dejó reposar en oscuridad por 10minutos.
Finalmente, se observó al microscopio de epifluorescencia.
RESULTADOS
El análisis deimágenes para la enumeración de bacterias acuáticas y acoplada con el microscopio de epifluorescencia se ha convertido en una herramienta cuantitativa.
En la fotografía se observa microoganismos teñidos con naranja de acridina que es un fluorocromo muy permeable que actúa como agente intercalante, interaccionando tanto con DNA como RNA. Su absorción de luz es máxima a 500 nm y emite una fluorescenciade color verde (520 nm).
Los teñidos con verde son aquellos activos en reproducción, mientras que los de color naranja los que están en crecimiento.
DISCUSION DE RESULTADOS
Para evaluar el papel ecológico de las bacterias heterotróficas en un sistema acuatico, el parámetro más básico que puede ser considerado es la biomasa. Con estos valores se puede determinar la actividad potencialpoblacional en el ambiente así como su potencial como fuente alimenticia parar niveles tróficos superiores (Azam et al. 1983; Bratbak 1993).
Sin embargo, una de las limitaciones para poder determinar este valor es que las características de las bacterias no permiten hacer la estimación de la biomasa por los métodos tradicionales ya que son células muy pequeñas, por debajo de 1.2 µm y los...
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