Espectrofotometria

Universidad Católica
De la Santísima
Concepción

Facultad de Educación

INFORME DE LABORATORIO Nº1
“METODOS USADOS EN LA BIOQUÍMICA: ESPECTROFOTOMETRIA”

Integrantes

Profesora:
Ayudante:Ramo: BIO0221


06-04-2009

INTRODUCCIÓN
El ojo humano responde a la radiación electromagnética en un intervalo de longitudes de onda entre 400-750 nm (es decir, el "espectro visible"). Muestras de la luz quecontienen un espectro continuo de todas las longitudes de onda entre 400-750 nm será percibido por el cerebro como “Luz Blanca” (por ejemplo el sol). (Glenn , 1967)
A menudo los objetos aparecen de color debido a su absorción selectiva de la luz dentro de las regiones del espectro visible. (Glenn, 1967)
El Espectrofotometría es un método de análisis óptico, es un instrumento que permite comparar laradiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de sustancia, son dispositivos de un solo canal en los que cada elemento del espectro se ve consecutivamente y no de forma simultánea. (Skoog, 1994)
Los espectrofotómetros se utilizan para medidas de absorbancia de las regiones ultravioletas, visible einfrarroja y para medidas de fluorescencia en las dos primeras. (Skoog, 1994)
Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida. (Glenn, 1967)
Las medidas espectroscópicas de concentración proteica utilizan un espectrofotómetro, en el que una cubeta de grosor ʅ que contiene una solución de la proteína secoloca en un haz de radiación monocromática de intensidad I0. La intensidad del haz emergente disminuirá hasta un valor I porque la solución absorbe parte de la radiación. La absorbancia a la longitud de onda λ se define como Aλ= log (I0/I) y está relacionada con ʅ y la concentración c por la ley de Beer:
Aλ = ελ / c
Donde ελ es el coeficiente de extinción a una longitud de onda λ para lasustancia concreta que se estudia. Sus dimensiones dependen de las unidades de concentración empleadas. Si la concentración de proteína se mide en mg/cm3 y con ʅ en cm, entonces ελ debe tener las dimensiones cm2/mg, dado que A es una magnitud sin unidades. En cambio, cuando las concentraciones se expresan en molaridad (M), las unidades de ε pasan a ser M-1 cm-1. Una vez determinado el coeficientede extinción de una proteína concreta, la concentración de cualquier otra solución de esa proteína puede calcularse a partir de una simple medida de absorbancia, utilizando la ecuación. Se emplea habitualmente el mismo método para los ácidos nucleicos, pero en este caso suele utilizarse una longitud de onda de 260 nm, dado que los ácidos nucleicos absorben más intensamente en esa región delespectro. (Mathews, 2002)
La segunda región de fuerte absorción en el espectro de las proteínas se encuentra entre 180 y 220 nm. La absorción de esas longitudes de onda surge de las transiciones electrónicas en el propio armazón polipeptídico, y como consecuencia es sensible a la conformación del armazón. De hecho, ambas regiones del espectro de absorción de las proteínas resultan algo afectadas porel estado conformacional. Los coeficientes de extinción cambian ligeramente cuando una molécula pasa de una forma globular a otra de ovillo aleatorio, porque se modifica el entorno local de todos los grupos, incluyendo las cadenas laterales aromáticas. Dado que la espectroscopia puede utilizarse con gran exactitud, pueden medirse incluso cambios pequeños y puede utilizarse para seguir la...