Espectrofotometria





UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA
LABORATORIO DE BIOMEDICINA

PRACTICA #1
ESPECTROFOTOMETRÍA

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: Analizar los conceptos físicos involucrados en la interacción de la luz y la materia, estudiando las aplicaciones de la espectrofotometría en la biomedicina.

ALCANCE DE LA PRÁCTICA: Al finalizar estapráctica el estudiante estará en capacidad de:
Manejar los conceptos teóricos relacionados con la espectrofotometría
Entender el principio de funcionamiento de un espectrofotómetro
Apreciar la utilidad de la espectrofotometría en el análisis cuali-cuantitativo de muestras de interés biomédico

APOYO TEÓRICO Y CONCEPTUAL

La luz es una Onda, ¿Qué es una Onda?
Para familiarizarnos con el conceptode onda pensemos en lo que le sucede a la superficie del agua de una piscina cuando cae una gota: se genera una ola en forma de círculo concéntrico respecto al lugar donde la gota cayó. Esta ola es una onda que se propaga por la superficie del agua a una cierta velocidad. Si las gotas caen constantemente, una tras otra a ciertos intervalos de tiempo, se genera una serie de olas que se propaganespaciadas por una distancia (longitud de la onda).
Una onda electromagnética es similar a la onda en el agua con la gran diferencia que la perturbación no necesita un medio, como el agua, para propagarse y lo hace a una gran velocidad (300.000 Km/seg). Las ondas electromagnéticas interactúan con la materia de diferentes maneras dependiendo de su longitud de onda. Habitualmente nos referimos aellas con nombres diferentes, por ejemplo: ondas de radio, microondas, rayos x, luz visible. Todas ellas son manifestaciones del mismo fenómeno. La luz visible por ejemplo corresponde solo a una pequeña parte del gran espectro de la radiación electromagnética.




















Figura 1. Representación esquemática de la propagación de una onda.






Figura 2.Espectro electromagnético
Interacción de la luz con la materia

La luz blanca es la mezcla de todos los colores (longitudes de onda) y cuando interactúa con un objeto éste puede selectivamente absorber algunas longitudes de onda (absorbancia) y dejar pasar otras, por lo tanto la longitud de onda a la cual absorbe una sustancia es una característica propia que puede ayudar a identificarla;adicionalmente la absorción de luz es proporcional a la cantidad de moléculas de la sustancia presentes en una muestra, siendo posible utilizar este principio como una herramienta analítica para estimar su concentración.
Esta técnica es conocida como espectrofotometría. Es ampliamente difundida en todas las áreas de la ciencia y se considera que hoy en día es una de las técnicas analíticas de mayor dominioen el mundo gracias a la popularización de los instrumentos de medida (espectrofotómetros) los cuales están compuestos de una fuente de luz, un monocromador que selecciona las longitudes de onda deseadas, un soporte para la muestra y un detector. El principio de funcionamiento es bastante simple (figura 3) y se basa en determinar la cantidad de luz absorbida por la muestra, determinada de formaindirecta, pues el detector reconoce es la intensidad de luz transmitida (% de transmitancia - %T) y conociendo la intensidad inicial (I0) es posible calcular la luz absorbida (absorbancia - A) utilizando esta relación: . Actualmente los espectrofotómetros realizan este cálculo de manera rutinaria y presentan los resultados como A ó %T.


Figura 3. Esquema de funcionamiento de unespectrofotómetro

Ley de Beer-Lambert
La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración y puede correlacionarse utilizando esta ecuación:

 (Ecuación 1)
Donde:
A: Absorbancia
ε: Coeficiente de absortividad (valor propio de cada sustancia, se encuentra en la literatura)
b: Longitud de la cubeta (por lo general es 1 cm)
c:...