Espectrometria

Espectrofometría:
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puedeseleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.
En esta práctica se darán a conocer las características generales y conceptos relacionados con la espectrofotometría. A continuación y tras la explicación del funcionamiento del espectrofotómetro se harán espectros de absorción con el fin de determinar la longitud de onda donde lamuestra presenta la máxima absorción, y tras realizar las correspondientes rectas de calibrado se cuantificarán las concentraciones de distintas biomoléculas.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización
de técnicas analíticas que permitan su determinación cualitativa y cuantitativa,
así como su caracterización físico-química ybiológica. Uno de los métodos
más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectroscopía, en general, y
la espectroscopía ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y
cuantificar biomoléculas en solución y en muestras biológicas, con el empleo
de reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman
un producto coloreado que permite detectarlo enmuestras complejas.

El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas
para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UVvisible.
Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber Y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura Atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica,constante dieléctrica), por lo que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma
de energía interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la
fotosíntesis en plantas y bacterias. Cuando la luz (considerada como energía)
es absorbida por una moléculase origina un salto desde un estado energético
basal o fundamental, E
1
, a un estado de mayor energía (estado excitado), E
. Y
sólo se absorberá la energía que permita el salto al estado excitado. Cada
molécula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del
resto de moléculas. Como consecuencia, la absorción que a distintas
longitudes de onda presenta una molécula-esto es, su espectro de absorción-
constituye una seña de identidad de la misma. Por último, la molécula en forma
excitada libera la energía absorbida hasta el estado energético fundamental.
La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400
nm. Es una región de energía muy alta. Provoca daño al ojo humano así como
quemadura común. Los compuestos con dobles enlacesaislados, triples
enlaces, enlaces peptídicos, sistemas aromáticos, grupos carbonilos y otros
heteroátomos tienen su máxima absorbancia en la región UV, por lo que ésta
es muy importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de
compuestos orgánicos. Diversos factores -como pH, concentración de sal y el
disolvente- que alteran la carga de las moléculas, provocan desplazamientos
de losespectros UV.
La fuente de radiación ultravioleta es una lámpara de deuterio.

En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que
corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El
color que absorbe es el complementario del color que transmite.
Por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la
longitud de onda en la...