Espectroscopia ultravioleta

ESPECTROFOTOMETRÍA ULTRAVIOLETA

1. FUNDAMENTOS DE LA TÉCNICA
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea unespectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.
En esta práctica se dieron a conocer las características generales y conceptos relacionados con la espectrofotometría y la explicación del funcionamiento del espectrofotómetro se harán espectros de absorción con el fin de determinar lalongitud de onda donde la muestra presenta la máxima absorción, y tras realizar las correspondientes rectas de calibrado se cuantificarán las concentraciones de distintas biomoléculas.

INSTRUMENTACIÓN PARA LA MEDICIÓN DE ABSORBANCIAS DE LA LUZ VISIBLE Y ULTRAVIOLETA: ESPECTROFOTÓMETRO UV-VISIBLE
La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos aparatos llamadosespectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en especial con la incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los espectrofotómetros constan, según se indica en la figura, de:
1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.
2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada longitud de onda: filtros, prismas, redes de difracción.
3. Uncompartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o sílice fundido, porque el vidrio no transmite la radiación UV.
4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en señales eléctricas.
5. Un registrador o sistema delectura de datos.



TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA
Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide perpendicularmente sobre una disolución de un compuesto químico que absorbe luz o cromóforo, el compuesto absorberá una parte de la radiación incidente (Ia) y dejará pasar el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It
La transmitancia (T) de unasustancia en solución es la relación entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz que incidió sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io x 100 La transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T y laconcentración no es lineal, pero asume una relación logarítmica inversa.
La absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% eindica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0.
La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la luz a través de la solución del cromóforo y de la concentración de éste.
LEY DE LAMBERT-BEER
Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo ensolución:
A = log I/Io = ε•c•l
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia que recorre la luz por la solución a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y por último, depende de ε, una constante de...