Estructura De Macromoleculas

Prácticas de
Estructura de Macromoléculas
2012



Licenciatura de Bioquímica/Grado de Biotecnología















Javier Sancho. jsancho@unizar.es
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular & Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI). Facultad de Ciencias. Universidad de Zaragoza


Práctica nº 1: Obtención de coordenadas demacromoléculas del PDB y visualización de su estructura tridimensional.

1. INTRODUCCION

Las coordenadas XYZ de los átomos de una macromolécula son la información necesaria para representar su estructura. Las coordenadas de las macromoléculas cuya estructura tridimensional se ha resuelto por difracción de Rayos X o resonancia magnética nuclear se encuentran depositadas en el Protein Data Bank(PDB). Al PDB se accede fácilmente por Internet: http://www.rcsb.org/. Una vez ahí se introduce el código PDB de la proteína deseada o se realiza una búsqueda por palabras (en inglés).

2. VISUALIZACION DE ESTRUCTURAS DE PROTEINAS CON EL PROGRAMA SPDBviewer

SPDBviewer (http://us.expasy.org/spdbv/) es un programa gratuito que permite representar la estructura tridimensional de moléculasutilizando coordenadas con formato pdb. Se puede utilizar al margen de Internet, como una aplicación independiente, abriéndolo y cargando las coordenadas o se puede utilizar como un programa auxiliar del navegador de internet que se activa automáticamente cada vez que hace falta.
Una vez cargada una molécula en SPDBviewer podemos verla de diversas maneras: como varillas, como bolas y varillas, comobolas, sólo los carbonos alfa de cada aminoácido, solo unas cintas que representan el discurrir del polipéptido, etc.
La molécula se puede rotar, trasladar y ampliar o reducir convenientemente. Se puede ver los puentes de hidrógeno, etc.

3. EJERCICIOS

 1nfn ¿Qué proteína es? ¿A qué tipo estructural pertenece? ¿Cuál es el aminoácido C-terminal de la hélice N-terminal?
 1flv ¿Quéproteína es? ¿A qué tipo estructural pertenece? ¿Qué aminoácidos aromáticos están en contacto con el grupo prostético FMN?
 1hti ¿Qué proteína es? ¿A qué tipo estructural pertenece? ¿Cuántas metioninas contiene?
 1aqb ¿Qué proteína es? ¿A qué tipo estructural pertenece? ¿Cuál es su cofactor? ¿Qué aminoácidos polares se encuentran en contacto con el cofactor?
 ¿Cuántos mutantes de la lisozima delfago T4 se han cristalizado?
 Visualizar algún complejo proteína/DNA
 Visualizar alguna molécula de DNA
 Visualizar algún carbohidrato
 Comparar la estructura de la ribonucleasa barnasa resuelta por difracción de rayos X (1a2p) con la determinada por RMN (1bnr).

Práctica nº 2: Medida de la estabilidad conformacional de la lisozima de huevo mediante desnaturalización química.

1.INTRODUCCION

La conformación plegada, nativa, de las proteínas es la más estable sólo en un determinado intervalo de valores de temperatura, pH, fuerza iónica, etc.
Una forma sencilla de determinar la estabilidad de una proteína es realizar una desnaturalización térmica registrando el valor de alguna propiedad de la proteína en función de la temperatura y ajustando los datos obtenidos a un modelorealista del equilibrio de desnaturalización témica. Otra forma, análoga, es mediante desnaturalización química, utilizando una sustancia que desestabilice la conformación nativa. Este segundo método, que es extratermodinámico, recibe el nombre de método de extrapolación lineal (LEM). En esta práctica vamos a utilizarlo para determinar la estabilidad de la proteína lisozima empleando cloruro deguanidinio como desnaturalizante.

2. REACTIVOS

• Tampón acético/acetato sódico 45 mM, pH 3.6
• Lisozima 10mg/ml en tampón acético/acetato sódico 45 mM, pH 3.6
• Cloruro de guanidinio 7M en tampón acético/acetato sódico 45 mM, pH 3.6

3. PROCEDIMIENTO

• Preparar, en viales Eppendorf, 950 µl de cloruro de guanididio 0, 0,5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6 y 6.5 M, por...