Extracción y electroforesis en geles de agarosa de ADN cromosómico.

Ingeniería Bioquímica, Bioquímica del nitrógeno, Práctica 2, 2013.Págs. 7

Extracción y electroforesis en geles de agarosa de ADN cromosómico.
Fernando F. Orona Mendoza

Instituto Tecnológico de La Paz.

Laboratorio de Bioquímica.

La Paz B.C.S a 3 de noviembre del 2013.


Resumen.
La extracción y purificación de ácidos nucleídos es un requisito imprescindible para realizar diversastécnicas en biología molecular, esto se debe a que como el ADN esta en el núcleo o en el interior de la célula como tal, una alteración en el equilibrio de esta puede ocasionar grandes daños al ADN. En esta práctica se ilustra como aunque el objetivo es determinar la longitud de un genoma en base a su peso molecular mediante electroforesis en geles de agarosa, una extracción y purificación conbuenos rendimientos es clave para poder lograr el objetivo. En la extracción y purificación se siguió básicamente el mismo protocolo para la extracción de ADN de gallus gallus, mangifera indica, homo sapiens, sacharomyces cereviceae, Escherichia coli, que consto de una lisis celular llevada a cabo mediante detergente, disrupción mecánica y ayuda de proteinasas; debido a que la lisis libera enzimasque podrían degradar el ADN se agregaron buffers y EDTA un agente quelante para eliminar la actividad de las enzimas, también se trato de mantener la muestra a temperaturas bajas; una vez lograda la liberación del ADN de la célula se procedió a purificarlo, para esto se llevaron a cabo varias centrifugación combinadas con sales como acetato de amonio para precipitar las proteínas desnaturalizadasy polisacáridos, y alcoholes para precipitar el ADN y separarlo así de la fase acuosa. Una vez se obtuvo el ADN se procedió a hacerlo correr en la electroforesis en geles de agarosa, y para ello se prepararon geles de agarosa con una concentración especifica, se agrego un bromuro de etidio para poder visualizar la muestra posteriormente y un marcador para comparar el peso molecular del ADN. Selogro visualizar 2 bandas de electroforesis una del ADN de H. sapiens y la otra de E. coli y se comparo con el marcador que se utilizo.

Introducción.
Extracción y purificación de ADN.
La aplicación de las diferentes técnicas empleadas en biología molecular para el análisis del genoma, depende en gran medida de la habilidad para extraer el ADN. Para lo cual se utilizan diversos métodos deextracción, dependiendo del tipo de tejido a emplear. Es una etapa crítica, porque el rendimiento final puede verse reducido si no se rompen bien las células, o si no se protege el ADN durante el proceso. (Reinaldo Velazco, 2005)
En seguida, se deben destruir las membranas celulares de manera que el ADN, acompañado de otros compuestos (proteínas, enzimas, carbohidratos), quede disponible.Para romper el tejido y suspender los núcleos en la solución se utilizan métodos mecánicos. Generalmente se efectúa una homogenización (con mortero, taladro, torno, o vórtex) que tiene por objeto romper el tejido y molerlo a un grado muy fino. Es muy importante en esta fase proteger al ADN de la acción de las nucleasas endógenas (que normalmente se encuentranfuera del núcleo, pero que pueden entrar en contacto con el ADN durante la ruptura de las células). La cantidad y la calidad del ADN obtenido al final del proceso son directamente proporcionales al grado de ruptura del tejido tratado y al nivel de protección logrado. (Facultad de ciencias agrarias, Practica No.1)
Debe lograrse que el ADN se disociecompletamente de las proteínas y otros contaminantes que pueden coextraerse y por lo tanto interferir con los análisis subsiguientes. También debe evitarse perder una cantidad significativa de ADN junto con los restos celulares. La mezcla de tejido así obtenida se agrega a una solución buffer o tampón de extracción, en presencia de agentes quelantes, de soluciones de baja o alta fuerza iónica (para que...