EXTRACCI N DE ADN DE TEJIDO HEP TICO

EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDO HEPÁTICO
EL ADN son largos polímeros de nucleótidos unidos covalentemente entre sí en una secuencia definida, formando polinucleótidos y son las moléculas informativas por excelenciar. Las dos clases principales de ácidos nucleicos son: ADN (ácido desoxirribonucleico), y ARN (ácido ribonucleico). La secuencia concreta de nucléotidos en una molécula de DNA o RNAconstituye la estructura primaria de la molécula. Uno de los ácidos nucleicos presentes en las células es el ARN, el cual es de una sola cadena polinucleotídica que contiene uracilo en lugar de timina. La función principal de los ARNs es la de ser intermediarios informativos entre el DNA y las proteínas. El DNA es la molécula informativa por excelencia y alberga los genes (secuencias de nucleótidos).Consiste en dos cadenas polinucleotídicas, complementarias, antiparalelas y de giro derecho alrededor de un eje imaginario. En este caso veremos la información contenida en un tejido hepático.
OBJETIVOS:
*Demostrar la presencia del DNA en las células y estudiar algunas de sus características en todo el procedimiento.
*Ver una manera manual y tópica de extracción de DNA, en la actualidad conmaquinaria tecnológica para este tipo de procedimientos.

MATERIALES
- Tejido Hepático (pollo)
- 20 ml NaCl 2M
- 20 ml NaCl 0.0002M
- 20 ml de alcohol de 96º Etanol
- 01 Mortero
- 10 ml de detergente SDS
- 01 Probeta de 25 mL.
- Pipeta calibrada
- 01 Beaker de 50 mL.
- 01 Pizeta con H2O destilada
- 01 gotero
-Frascos de ependor
-Otros.
PROCEDIMIENTO EXTRACCION DEL ADN
1*Triturar 1 gr. detejido hepático en un mortero, para lograr la separación de células en este caso hepatocitos.
2*Añadir al triturado, 5 ml de solución salina hipotónica, con esto lograremos la lisis celular y mediante esto la separación de organelas, entre ellas el núcleo donde se encuentra el DNA. Remover hasta hacer una especie de papilla o puré, colocarlo en tubo cornig.
3*Centrifugar por 05 minutos a 3000 rpm.Eliminar el sobrenadante.
4*Añadir al precipitado un volumen 3 ml de cloruro sódico 5M (HIPERTONICO), esto con el fin de obtener el sobrenadante y el sedimento. Eliminamos por decantación.
5*a continuación se añade 1 ml de detergente SDS 10%. La mezcla se agita por 10 minutos. La acción del detergente es formar un complejo con las proteínas y separarlas del ADN. Así quedará el ADN libre de lasproteínas que tiene asociadas.
6*Se añaden 03 ml de una mezcla de cloroformo alcohol isoamilico se inicia una agitación de 20 minutos, para separar las proteínas y lípidos ligados al DNA.
7* Centrifugar por 10 minutos a 3000 rpm. Retirar el sobrenadante y depositarlo en una probeta de 10 ml. - Añadir con una pipeta 50 ml de alcohol de 96º. HELADO, Hay que hacerlo de forma que el alcohol resbalesuavemente por las paredes del recipiente (NO MEZCLAR) y se formen tres capas, organica, Interfase y acuosa, trabajamos con la fase acuosa. En la interfase, precipita el ADN.
8* Introducir una varilla de vidrio e ir removiendo y rotándola entre los dedos en la misma dirección. Evite realizar movimientos bruscos durante esta operación. Sobre la varilla se van adhiriendo unas fibras blancas, que sonel resultado de la agrupación de muchas fibras de ADN.
9*Veremos en primera estancia al DNA como un halo blanquecino, utilizares un método de contracción y el DNA se vera de manera correcta e dispersa. Ya lograremos ver el DNA de forma de halo y blanquecina.












































PURIFICACION DE ADN - TEJIDO HEPÁTICO


1) Retirar el sobrenadante que contiene el ADNen un frasco EPENDORF

Centrifugar por 10 minutos a 3000 rpm. Retirar el sobrenadante. Dejar secar por 5 minutos.

2) Adicionar 2 mL de etanol, agitar durante 5 minutos.

3) Centrifugar por 10 minutos a 3000 rpm. Retirar el sobrenadante. Dejar secar por 5 minutos.
4) Adicionar 2 mL de etanol, agitar durante 5 minutos

5) Centrifugar por 10 minutos a 3000 rpm. Retirar el...