Extracción de leucocitos

eProtocolo para extracción de ADN de leucocitos.

Notas previas a la extracción:

* Mezclar bien los componentes del kit antes de usarlos para garantizar una composición uniforme.
* Tubosnuevos esteriles de 1.5 ml, Isopropanol. Baño María a 37ºC, uso de bata, cubre boca, guantes nuevos de latex y desinfetados.
En una mesa desinfectada con alcohol:

1. Colocar 300 microlitros demuestra (previeamente homogeneizada) en un tubo limpio de eppendorf de 1.5 ml.
2. Añadir 600 Ml de solución de lisis de células rojas e invertir 10 veces para mezclar, asegurándose que quedehomogéneo y en su caso, desprender algún cumulo en el fondo del tubo.
3. Incubar a temperatura ambiente por 5 min y mezclar por vortex 30 seg.
4. Incubar nuevamente por 5 min y mezclar por vortex30 seg.
5. Centrifugar la muestra a 4ºC/1min/14, 000 rpm.
6. Decantar el sobrenadante y mezclar el remanente por vortex 30 seg.
7. Resuspender la pastilla 300 ML de solución 2X T y C porpipeteo.
8. Incubar en hielo durante 5 min.
9. Añadir 1 Ml de RNasa a cada muestra y mezclar por inversión 10 veces.
10. Incubar en hielo 5 min.
11. Adicionar 50 Ml de solución 2X T y Cy mezclar por inversión 10 veces.
12. Incubar en hielo 5 min.
13. Adicionar a cada muestra 200 Ml de Reagente Precipitador de Proteínas MPC y agitar por vortex.
14. Centrifugar a 4ºC/10min/14, 000 rpm.
15. Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf de 1.5 ml que contiene 500 Ml de isopropanol y mezclar por inversión hasta que se observe totalmente transparente.
16.Centriiugar a 4º/10 min/14, 000 rpm y decantar el sobrenadante.
17. Lavar la pastilla 2 veces con 500 Ml de etanol al 70% grado biología molecular, centrifugar a 4ºC/3min/14, 000 rpm, al final delsegundo lavado remover el etanol con micropipeta sin dañar la pastilla, dejar evaporar el etanol por 15 min a temperatura ambiente.
18. Resuspender la pastilla en 35 Ml de agua inyectable, tomar 1 Ml...