Fraccionamiento Celular • Análisis De Disacaridasas Para Comprobar La Pureza De La Fracción Obtenida

FBA III. Fisiología Animal
Practica 2. Modulo de fraccionamiento celular
* Análisis de disacaridasas para comprobar la pureza de la fracción obtenida
| |   | [glucosa](µmol/ml) |   | | |
REPLICA | BLANCO | 2(µmol/ml) | 4(µmol/ml) | 8(µmol/ml) | 16(µmol/ml) | |
| |
1 | / | 0,085 | 0,203 | 0,386 | 0,789 | Absorbancia |   |
2 | / | 0,089 |0,202 | 0,430 | 0,744 | medida a |   |
MEDIA | / | 0,087 | 0,203 | 0,408 | 0,767 | 505 nm |   |
Cuantificación de glucosa en las muestras obtenidas y cálculo de la AE

| Homogenizado Puro | Pellet | Sobrenadante | |
REPLICA 1 |   | 0,104 | 0,670 | 0,071 | Absorbancia |
REPLICA 2 |   | 0,118 | 0,697 | 0,045 | medida a |
MEDIA |   | 0,111 | 0,684 |0,058 | 505 nm |

Una vez obtenida, la recta patrón que relaciona las concentraciones de glucosa conocidas con el espectro de absorción de cada una de ellas, es necesario determinar la concentración de glucosa en los distintos extractos de la muestra que hemos obtenido, para lo que sustituiremos el valor medio del espectro de absorción de las distintos fracciones, en la recta patrón;obteniendo así, la concentración correspondiente de glucosa para cada uno de ellos. Dado que el homogenado puro se ha preparado como una dilución 1:5, es necesario, una vez obtenido su concentración, aplicar el susodicho factor de dilución, para obtener la concentración real de proteína en la muestra sin diluir; de este modo:
Homogenizado Puro:

y= 0,0481x + 0,0052 0,111= 0,0481x + 0,0052x=2,196 µmol/ml de glucosa en una dilución 1:5.
y=0,111

Aplicamos el factor de dilución (x 5) 2,196 x 5= 10,986 µmol/ml de glucosa

Pellet:

y= 0,0481x + 0,0052 0,6835= 0,0481x + 0,0052 x=14,11 µmol/ml de glucosa

y=0,6835

Sobrenadante:

y= 0,0481x + 0,0052 0,058= 0,0481x + 0,0052 x=1,096 µmol/ml de glucosay=0,058

A continuación, se va a proceder al cálculo de la actividad enzimática. La actividad enzimática se expresa en Unidades Internacionales: una Unidad hidroliza 1 µmol de disacárido por minutos a 37º C(mamíferos). Dado que nuestro tiempo de incubación ha sido de 60 min. es necesario dividir la concentración de cada una de las muestras, entre el tiempo de incubación, para obtener la AE, ensus unidades correspondientes:

Homogenizado Puro:

AE =[GLUCOSA]/MIN
AE= 10.986/ 60= 0.183 U
[GLUCOSA] =10.986 µmol/ml

Pellet:

AE =[GLUCOSA]/MIN
AE= 14.11/ 60= 0.235 U
[GLUCOSA] =14,11 µmol/ml

Sobrenadante:
AE =[GLUCOSA]/MIN AE= 1,096/ 60= 0.018 U
[GLUCOSA] =1,096 µmol/ml
Por último vamos a medir la Actividad enzimática específica(AEE), la cual se expresa en U/gr proteína, por lo es necesario cuantificar la cantidad de proteína en las muestras de homogenizado puro, sobrenadante y pellet, a partir de la realización de una recta patrón generada a partir de concentraciones de proteína conocidas, que relaciona estas con su espectro de absorción. El procedimiento para la obtención de las concentraciones es el mismo que elutilizado para la glucosa (aplicando también el factor de dilución para el homogenado puro):

| |   | [proteina](µg/100µl) |   | | |
REPLICA | BLANCO | 20(µg/100µl) | 40(µg/100µl) | 60(µg/100µl) | 80(µg/100µl) | |
| |
1 | / | 0,088 | 0,338 | 0,764 | 0,799 | Absorbancia | |
2 | / | 0,072 | 0,322 | 0,777 | 0,742 | medida a | |
MEDIA | / | 0,076 |0,330 | 0,771 | 0,771 | 595 nm | |

| Homogenizado Puro | Pellet | Sobrenadante | |
REPLICA 1 |   | 0,935 | 0,924 | 0,901 | Absorbancia |
REPLICA 2 |   | 0,956 | 0,960 | 0,923 | medida a |
MEDIA |   | 0,946 | 0,942 | 0,912 | 595 nm |

Calculo de las concentraciones de proteína a partir de la recta patrón:
Homogenizado Puro:

y= 0,0127x - 0,1445 0,946= 0,0127x - 0,1445...