Genómica

GENOMICA
Fundamentos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Involucra:
- Dos cebadores de oligonucleótidos (17-30 nucleótidos)
- Alineación de los cebadores en los flancos de la secuencia “blanco “
- La polimerasa extiende las cadenas creando dos dobles cadenas de ADN “blanco”
- Cada uno de los fragmentos creados está listo para otro ciclo de desnaturalización, alineación yextensión
- Los ciclos subsecuentes repiten el mismo protocolo de desnaturalización, alineación y extensión, acumulando exponencialmente la concentración de la secuencia de interés.
- Es llamado amplificación
- Después de 22 ciclos una amplificación de 106 veces es alcanzada

PCR cuantitativa (tiempo real)

*La especificidad de la reacción depende en gran medida de los cebadores.
* Debenser entre 17 a 30 nucleótidos en longitud
* El contenido de GC debe ser del 50% aprox.
* Secuencias con varias repeticiones de un solo nucleótido deben evitarse (3 o 4)
* Cebadores con significante estructura secundaria son indeseables
* Evitar complementaridad entre dos cebadores
* La PCR ordinaria es cualitativa, o en el mejor de los casos semicuantitativa cuando se midela intensidad de la fluorescencia
* La PCR de tiempo real es cuantitativa y monitorea la amplificación del producto
*La técnica fue desarrollada debido a
* La necesidad de cuantificar diferencias en la expresión de ARNm
* La baja disponibilidad de ARNm en algunas extracciones como
* Células obtenidas por microdisección de captura laser
* Pequeñas cantidades de tejido* Células primarias
* Compuestos bajo estudio muy costosos
* De las tecnologias en las que el ARNm (como Northern Blot) se puede cuantificar, PCR es la mas sensible
* El principio de la cuantificacion se basa en la relación directa que existe en la cantidad de material inicial (secuencia “blanco”) y la cantidad de producto PCR en cualquier ciclo.
* La amplificación producecantidades crecientes de ADN de doble cadena, el cual, en presencia de un fluoróforo produce tambien incrementos en la fluorescencia, la cual puede ser cuantificada
* Si se grafica el incremento en la fluorescencia vs el numero de ciclos, es posible analizar la cinética de PCR en tiempo real
* Hay varias consideraciones para entender la cuantificacion

* Supongamos que existe 10 veces lacantidad de señal en la muestra experimental comparada con la muestra control para el gen “blanco”
* Esto podria significar que la expresión del gen se ha incrementado 10 veces en las células experimentales o simplemente que la “carga” fue mucho mayor por efecto de la técnica
* Para estandarizar las cantidades de señal, se deben usar genes de referencia (“housekeeping”) que sirven como“normalizadores” o controles internos
* Housekeeping sirven como base en las expresiones (referencia)
* En fluorecencia está la fase exponencial que es proporcional a la cantidad inicial
* Estos genes deben poseer las siguientes propiedades:
* Tener el mismo número de copias en todas las células estudiadas
* Debe estar expresado en todas las células
* Entre los genes dereferencia mas usados, se encuentran: GAPDH (ARNm), Beta actin (ARNm), MHC I (ARNm), 28S o 18S (ARNr), Ciclofilina (ARNm).
* Para hacer la cuantificacion hay que pensar que la cantidad de ADN se duplica en cada ciclo. Asi tenemos que depues de 2 ciclos tenemos 2X2 veces de lo que se tenía al principio, después de 3 ciclos, es 2X2X2 (o 23), despues de 4 será 2X2X2X2 (o 24). Entonces después de Nciclos tendremos 2N
* Pero la reacción no continúa por siempre y una fase “plateau” es alcanzada
* La cuantificación se realiza utilizando la pendiente de la fase exponencial
* La cuantificación se realiza utilizando una ecuación que toma en cuenta el número del ciclo en el que se ha cruzado el umbral de fluorescencia definido por el usuario.
* Otro parámetro que se toma en...