Genetica

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Soluciones QPCR

Protocolo y Técnicas

Cultek

Extracción y purificación de los ácidos nucleicos
Todos los tipos de macromoléculas biológicas tienen una característica en común que va a permitir el desarrollo de un método de separación especifico para ellas. Estos métodos deben ser completamente biocompatibles para que puedan ser posteriormente útiles al investigador y, al mismo tiempo, losuficientemente potentes para permitir el aislamiento de la molécula deseada de entre un mezcla compleja de multicomponentes que hacen las veces de “contaminantes” de nuestra molécula en cuestión. En este sentido, la cromatografía en columna ha demostrado ser una herramienta muy útil ya que se dispone de varios mecanismos de separación. La modificación de las diferentes fases estacionarias yaexistentes, así como el desarrollo de nuevas es la base principal para la obtención de las condiciones necesarias para la rápida y eficiente separación de biomoléculas. • Cromatografía de penetrabilidad. El componente básico es una columna empaquetada con una matriz en gel especial, que son partículas de un polímero orgánico de estructura tridimensional, que originan una red de poros hidrofílicosequilibrados con un tampón acuoso. La técnica consiste en que las moléculas de gran tamaño no penetran por los poros del polímero, por lo que migran mucho más rápidamente que las de menor tamaño que sí son capaces de penetrar por los poros de la matriz. Al principio del desarrollo de la técnica, se realizaba a bajas presiones por lo que el rango de aplicaciones estaba restringido debido a loselevados tiempos de separación y su poca resolución. En la actualidad se han desarrollado matrices de sílica estables a elevadas presiones que se utilizan columnas de alta presión, para la separación de biomoléculas en función de su forma y tamaño.

• Cromatografía de intercambio iónico. Es el método más utilizado para la separación de ácidos nucleicos. El mecanismo básico es el intercambio reversiblede los iones en solución con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero eluirá de la columna al cambiar al pH del tampón (tampón de elución) ya que los iones del tampón de elución interaccionan con los gruposcargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico, respectivamente; primero eluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elución, eluirán las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

02.2006

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Una modificación de este método es la extracción en fase sólida, en la que se utiliza una matriz intercambiadora de aniones empaquetada en columnas de polipropileno. La unión se produce bajo condiciones de baja salinidad y durante los pasos de lavado y elución se va incrementando la concentración de sales en los tampones correspondientes. Las impurezas se eliminan debido a sudiferente capacidad de unión y se obtienen una rápida y eficiente purificación de los ácidos nucleicos (DNA y/o RNA).

• Cromatografía de adsorción. Se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia de sales caotrópicas. Bajo condiciones nativas, los ácidos nucleicos están recubiertos de una capa hidratante de moléculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA ensoluciones acuosas. Con la adición de iones caotrópicos a los ácidos nucleicos, se destruye esta ordenada estructura de moléculas de agua de la capa hidratante, por lo que las sales caotrópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor del DNA. Bajo estas condiciones hidrofóbicas, los ácidos nucleicos se unen perfectamente a la membrana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas, los...
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