Grafica

CONCEPTOS BASICOS DE ESPECTROFOTOMETRIA















RONALD AUGUSTO CHARRY GUZMAN
Código: 62875














UNIVERSIDAD INCCA DE COLOMBIA
Facultad de Ingeniería de Alimentos
febrero de 2014
Bogotá D.C.

OBJETIVOS

Analizar las leyes físicas que rigen a la espectrofotometría.
Identificar las partes de un espectrofotómetro.
Observar el cumplimiento dela ley de “Beer” a travez de la curva de calibración.


INTRODUCCIÓN


La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas (como se muestra en la figura 1) y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración.Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.


FIGURA 1: Funcionamiento básico de un espectrofotómetro



















La cantidad de luz absorbida de una muestra se expresa como una fracción entre 0 y 1 llamadaabsorbancia (A), o como un porcentaje entre 0% y 100% de transmisión de luz o % de Tramitancia (T).

Ley de Lambert-Beer

Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:

A = log I/Io = ε·c·l

La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración (a mayor número de moléculasmayor interacción de la luz con ellas); también depende de la distancia que recorre la luz por la solución (a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más
moléculas se encontrará); y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad (denominada coeficiente de extinción) que es específica de cada cromóforo. Como A es adimensional, las dimensiones de εdependen de las de c y l. La segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se hace, siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de ε resultan ser M-1·cm-1. Este coeficiente así expresado, en términos de unidades de concentración molar (o un submúltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extinción molar (εM). Cuando, por desconocerse el peso moleculardel soluto, la concentración de la disolución se expresa en otras unidades distintas de M, por ejemplo g·L-1, las dimensiones de ε resultan ser distintas, por ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado se denomina coeficiente de extinción específico (εs).

La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos, ε varía con la concentración, debido a fenómenosde dispersión de la luz, agregación de moléculas, cambios del medio, etc


REACTIVOS UTILIZADOS

Solución coloreada de permanganato de potasio (KMnO4) concentrado a 20 mM, y agua destilada para realizar diluciones.




PROCEDIMIENTO


En este laboratorio se realizó el siguiente procedimiento:




Solución
KMnO4 20mM


Preparación diluciones
(la guía dice lasconcentraciones a utilizar)



Poner en funcionamiento
El espectrofotómetro



Calibración de
espectrofotómetro



Lectura de diluciones
(esto se hace a diferentes longitudes de onda)



Consinación de los diferentes datos



Realización de curva de calibración
(determinar la longitud de onda ideal)



Fin







CUESTIONARIO


1. Rango de lectura espectrofotométrica delos siguientes compuestos; aminoácidos, proteínas, acidos nucleicos, NAD(P(H, carotenoides.


Compuesto
Absorción máxima λmáx (nm)
NADH
260
340
FAD
260
375
445
caroteno
Aprox. 450
Aminoacidos

274
222
193
DNA
258 6.6
RNA
258 7.4
Proteinas
280
Grupo hemo
10
120



2. ¿Qué tipo de sustancias reaccionan con las proteínas para que se puedan determinar por...