Guía Bioquimica

INSTITUTO DE CIENCIAS NATURALES

GUÍA N°
3
CINÉTICA ENZIMÁTICA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
2014


CINETICA ENZIMÁTICA

EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA EN REACCION ENZIMATICA
OBJETIVOS:
1. Determinar la velocidad
de la hidrólisis del p-nitrofenil-β-D-glucopiranosido,
catalizada por la β-glucosidasa, bajo diferentes condiciones de pH y Temperatura.
2. Determinar el efecto del pH y deTemperatura sobre la velocidad de la hidrólisis del
p-nitrofenil-β-D-glucopiranosido, catalizada por la β-glucosidasa
INTRODUCCION
La enorme variedad de reacciones bioquímicas que comprende la vida son mediadas,
casi todas ellas, por una serie de catalizadores biológicos conocidos como enzimas.
Las enzimas son proteínas con actividad catalítica, es decir aumentan la velocidad de
una reacciónquímica, permitiendo así que el sustrato se transforme en producto de
manera más rápida. La enzima se une al sustrato formando el complejo Enzima –
Sustrato, una vez que se ha formado el nuevo producto, la enzima se separa de este
quedando libre para recibir a otro sustrato.

La velocidad de las reacciones se determina de acuerdo al aumento de la concentración
del producto o la disminución dela concentración del sustrato de la reacción en el
tiempo.
Existen diferentes métodos que permiten cuantificar la concentración de reactantes y/o
productos. Entre los métodos analíticos físicos destacan los ópticos, que se basan en la
absorción de radiación electromagnética en la región visible y ultravioleta. Determinando
el coeficiente de extinción de un compuesto se estima la velocidadsobre la base de las
medidas experimentales de absorbancia a un tiempo dado. (Espectrofotometria, véase
guía de laboratorio 1, CQU-310 UDLA, 2013)
Hay diferentes factores que afectan la actividad de las enzimas. Los factores más
importantes son: concentración de enzima, concentración de ligandos (sustratos,
productos, inhibidores y activadores), pH, fuerza iónica y temperatura. (Véase clase 8,enzimas ll, Cátedra Bioquímica CQU-310, 2013)

2014

VICERRECTORÍA
ACADÉMICA
INSTITUTO DE CIENCIAS NATURALES
La actividad de las enzimas se ve notablemente afectada por el pH del medio. En
general, son sólo activas en un rango limitado de éste, observándose en la mayoría de los
casos una zona de pH óptimo y una disminución de la actividad a ambos lados del pH
“óptimo”. El efecto del pHen la actividad enzimática se debe fundamentalmente a cambios
en el estado de ionización de los componentes del sistema; esto puede darse en la enzima
libre, en el complejo E-S o en el sustrato. En la zona de pH óptimo predomina la forma
iónica activa, a valores de pH menores y mayores su proporción disminuye, aumentando la
proporción de formas iónicas no activas; a causa de ello la curva develocidad versus pH
tiene aproximadamente la forma de una campana. El pH no sólo afecta la actividad de las
enzimas, sino que también la estabilidad, lo que contribuye a la disminución de la actividad
generalmente a valores extremos de pH.
Las reacciones enzimáticas están fuertemente afectadas por la temperatura. Hay dos
factores determinantes, el efecto de la temperatura en las constantes develocidad de la
reacción y el efecto de la temperatura en la estabilidad de la enzima. Como es de esperar,
un aumento de la temperatura aumenta la velocidad de la reacción; sin embargo, sobre
cierta temperatura hay inactivación de la enzima que lleva a una disminución en la
velocidad. La zona de temperatura en la cual se observa mayor actividad se conoce como
“temperatura óptima”, ésta tienesólo valor operativo, ya que depende de una serie de
factores, como el pH y el tiempo de reacción.
En este práctico se verá el efecto que produce en la actividad de la enzima
βglucosidasa de almendra dulce, los cambios de pH y temperatura. Se determinará la
velocidad de la hidrólisis de un sustrato artificial, el p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido
(pNPG), midiendo la formación de un producto...