Gui N De Pr Cticas Expresi N G Nica

 

EXPRESIÓN GÉNICA Y SU REGULACIÓN  
PRÁCTICAS  

 

BIOQUÍMICA 2º CURSO 

CURSO 2014‐15 
 
 

Prácticas
Parte I; Biología Molecular Básica
 Práctica 1. Transformación de E. coli con DNA plasmídico.
 Práctica 2. Determinación cuantitativa, titulación, de una dilución de
bacteriófagos.
Parte II; Control de la expresión génica en bacterias
 Práctica 3. Control negativo: el operón lactosa.
Práctica 4. Control positivo: represión catabólica por glucosa en el
operón arabinosa.
 Práctica 5. Utilización del operón lactosa en un sistema de expresión
heteróloga de proteínas en bacterias.
Parte III; Mutación y reparación
 Práctica 6. Determinación de la viabilidad celular tras la exposición a
rayos UV.
 Práctica 7. Mutagénesis mediante el uso de transposones.
 

Cada grupo de trabajo deberáentregar al finalizar la semana de prácticas un
cuaderno de prácticas.Este cuaderno deberá contener una breve descripción
del objetivo y procedimiento de cada práctica junto con los resultados obtenidos
en cada una ellas así como las a las cuestiones que propuestas al final de cada
una de ellas.
 

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Práctica 1. Transformación de E. coli con DNA plasmídico 
 
 

La  transformación bacteriana  es  el  proceso  por  el  que  un  DNA  exógeno  es  introducido  en  el  interior  de  una 
bacteria,  si  esta  molécula  de  DNA  es  circular  y  tiene  un  origen  de  replicación  podrá  replicarse  en  la  bacteria  y  se  podrá 
obtener una gran cantidad de moléculas del DNA introducido en la misma.  
 
Si,  además,  la  molécula  de  DNA  proporciona  alguna  característica  nueva a  la  bacteria  donde  se  ha  introducido, 
podremos utilizarla esta característica para seleccionar la bacteria que contiene esa molécula de DNA. La característica más 
usada en para su selección es la adquisición de resistencia a antibióticos, esta viene determinada por la presencia en los 
plásmidos de genes que codifican para proteínas capaces de degradar los antibióticos. 
 Vamos a realizar la transformación de tres plásmidos problema, A, B y C que contienen genes que confieren a las 
bacterias resistencia frente diferentes tipos de antibiótico. Se utilizarán plásmidos conteniendo los genes que proporcionan 
resistencia a los antibióticos ampicilina y kanamicina. Figura 1. Esquema de un plásmido circular de clonaje estándar. Sobre el plásmido se indican sus componentes; un origen de replicación 
bacteriano  (ori),  genes  de  resistencia  a  los  antibióticos  ampicilina  ‐Ap‐  y  Kanamicina  ‐Kan‐,  el  gen  para  el  enzima  beta‐galactosidasa 
bacteriana (lacz) y una región con dianas de restricción únicas que permiten insertar el fragmento de DNA de interés para la obtención de 
moléculas recombinantes de DNA. 

Materiales; 
 
Medio de  cultivo  LB  (Luria‐Bertani)  líquido  sin antibiótico  (por  litro  contiene: Extracto  de  levadura,  5g; 
Bactotriptona; 10g; ClNa 10g; a pH 7.5). 
Placas petri con medio de cultivo LB sólido (al medio LB líquido se le añade 15g/L de agar). Serán placas 
sin  antibiótico  y  con  antibiótico.  Se  van  a  utilizar  placas  con  los  antibióticos  ampicilina  50  g/ml  y 
kanamicina 25 g/ml. 
Alícuotas  de  bacterias  competentes  para  la transformación.  Se  va  a  utilizar  la  cepa  XL1blue  que  se  ha 
tratado  con  Cl2Ca  0.1  M.  Se  piensa  que  el  tratamiento  con  cationes,  sirven  calcio,  rubidio  o  litio,  de 

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cultivos bacterianos en fase de crecimiento exponencial facilita la entrada de DNA exógeno en la bacteria. 
Las bacterias tratadas con calcio se mantienen a bajas temperaturas hasta su utilización. 
DNA deplásmidos a una concentración de 10 ng/l.
Se necesitará etanol para la esterilización de las asas de siembra, así como mechero y baños a diferentes
temperaturas. Puntas para pipetas automáticas y tubos eppendorf esterilizados.

Procedimiento;
Todo el material que se requiere para la utilización de esta práctica debe ser estéril y debe ser manejado cerca
de la llama del...