hibridacion in situ

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA
PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS
BIOQUÍMICAS

EVALUACIÓN FINAL CURSO DE MÉTODOS

COORDINADOR DEL CURSO: DR. ROBERTO STOCK

ALUMNA: BLANCA RAMOS CERRILLO

TEMA:HIBRIDACIÓN in situ

1

ÍNDICE
I. Introducción

1

II. Breve historia

1

III. Pasos y consideraciones de la hibridación in situ

2

IV.Preparación de la sonda

4

a) Diseño de sondas
b) Tipo de sonda y método de síntesis
c) Elección de la sonda

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d) Tamaño de la sonda
e) Estabilidad de la sonda
f) Sondas de doble cadena contra las de cadena sencilla

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V. Marcaje
a) (3H) Tritio
b) 35S
c) 32P
d) 33P
e) Marcaje con digoxigenina
f) Marcaje con biotina
g) Marcaje fluorescente de ácidos nucléicos
h)Métodos de marcaje para:
i) DNA
ii) RNA
iii) Oligonucleótidos

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8
8
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VI. Preparación de tejidos
a) Fijación
b) Tejido embebido y su seccionamiento

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VII. Tratamiento de la laminilla

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VIII. Pretratamiento del tejido
a) Tratamiento con solventes orgánicos
b) Tratamiento con proteasas para facilitar
la accesibilidad al RNA de interés
c) Inactivaciónendógena enzimática
d) Tratamiento con RNasas
e) Tratamiento con HCL
f) Tratamiento con detergentes

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g) Impedimento de enlaces
h) Pre-hibridación
i) Blancos del DNA

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IX. Pre-hibridación y desnaturalización de la sonda y su blanco

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X. Hibridación
a) Largo de la sonda
b) Composición de la sonda
c) Identidad
d)Composición de la solución de lavados de la hibridación
e) Desnaturalización del DNA
f) pH
g) Temperatura

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20
20
21
21
21

XI. Lavados post-hibridación

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XII. Detección
a) Sondas radioactivas
i) Grados de la emulsión
ii) Espesor de la emulsión
iii) Almacenamiento y vida media de la emulsión
iv) Condiciones de exposición
v) Tiempo de exposición
vi) Condiciones pararevelarla

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24
24
24
24
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b) Sondas marcadas con haptenos

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XIII. Técnicas de doble tinción

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XIV. Controles
a) Hibridación cruzada con secuencias de
ácidos nucléicos inespecíficos
b) Enlaces inespecíficos
c) Generación inespecífica de la señal
d) Ruido de fondo sobre tejidos específicos
e) Ruido de fondo de sondas marcadas con haptenos

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XV.Fotografía

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XVI. Microscopía
a) De campo claro
b) De campo oscuro
c) De contraste de fases
d) Microscopía de contraste de reflexión
e) De fluorescencia

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27
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3

f) Imágenes digitales
g) Microscopía electrónica
h) Flujo citométrico

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29
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XVII. Algunas otra técnicas: PRINS
a) Principios y métodos de in situ PCR
b) Amplificación insitu
c) Detección de productos de PCR en la célula
d) Eficiencia de PCR in situ
e) PCR in situ tiene una gran número
de aplicaciones en diagnóstico
f) Controles para PCR in situ

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XIX. Comparación de las técnicas de hibridación in situ

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32

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Abreviaturas
A
AP
BCIP
Bio
BrdU
C
cDNA
DAB
DAPI
DEPC
DIG
DMSO
DNasa
dsDNA
DTT
EDTA
FISH
FITCFLU
G
mRNA
NTB
PBS
PCR
PFA
RNasa
snRNA
snoRNA
ssDNA
STS
T
TBE
TBS
TE
TEMED
TESPA
Tm
Tr
tRNA
U
UV

Adenina
Fosfatasa alcalina
5-bromo-4cloro-3-indolil fosfato
biotina
5-bromo-4-cloro-3-indolid fosfato
citosina
DNA complementario
diaminobenzidina
4’,6-diamino-2-fenilindole
dietilpirocarbonato
digoxigenina
dimetilsufóxido
deoxiribonucleasa
doble cadena de DNAditiotreitol
ácido etilenoadiaminotretacético
fluorescence in situ hybridization
Fluorescencia in situ
Fluoresceína
Guanina
mRNA
4-nitroblue-tretrazolium chloride
buffer fosfato salino
reacción en cadena de la polimerasa
paraformaldheído
ribonucleasa
small nuclear RNA
small nucleolar RNA
cadena sencilla de DNA
sitio de pegado de la secuencia
timina
tris-borato-EDTA
tris buffer...