Hidrolisis Del Glucogeno

23. Hidrólisis ácida y enzimática del glucógeno
Emilia Martínez Galisteo, Carmen Alicia Padilla Peña, Concepción García Alfonso, José Antonio Bárcena Ruiz, Jesús Diez Dapena.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

El glucógeno posee una estructura ramificada con cadenas lineales de restosconsecutivos de glucosa, unidos por enlaces α(1-4), y por enlaces α(1-6) en los puntos de ramificación. El resultado es una estructura en abanico con un extremo reductor y muchos no reductores. La hidrólisis de estos enlaces glucosídicos puede ser catalizada por ácidos minerales o enzimas. En la hidrólisis ácida los enlaces se rompen al azar, con formación intermediaria de todos los posibles oligosacáridos yla conversión final de éstos en glucosa. La hidrólisis de los enlaces glucosídicos del glucógeno puede ser también llevada a cabo por la enzima α-amilasa, que cataliza la hidrólisis específica de los enlaces α(14) (no son afectados los enlaces α(1-6). Los productos finales de la hidrólisis enzimática del glucógeno son glucosa, maltosa e isomaltosa. Título corto: Hidrólisis del glucógeno. Palabrasclave: ácido clorhídrico, α-amilasa, glucógeno, hidrólisis. Abreviaturas empleadas. DNS: ácido 3´-5´-dinitrosalicílico.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS El glucógeno es la forma de almacenamiento de la glucosa en los tejidos animales. Se encuentra principalmente en el hígado y en el músculo representando hasta un 10% y un 1-2% de su peso húmedo, respectivamente. El glucógeno posee una estructuraramificada con cadenas lineales de restos consecutivos de glucosa, unidos por enlaces α(1-4), y por enlaces α(1-6) en los puntos de ramificación. La hidrólisis de estos enlaces glucosídicos puede ser catalizada por ácidos minerales. Éstos rompen enlaces al azar, con formación intermediaria de todos los posibles oligosacáridos y la conversión final de éstos en glucosa. La naturaleza polisacárida delglucógeno se pone de manifiesto demostrando el aumento de grupos reductores durante la hidrólisis, que se detectan mediante el reactivo 3’-5’-dinitrosalicílico (3’-5’-DNS). Este reactivo en presencia de azúcares reductores se reduce a ácido 3-amino-5-dinitrosalicílico (producto coloreado que absorbe a 540 nm).
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Existen numerosas enzimas que catalizan hidrólisis más específicas, por ejemplo,la α-amilasa de la saliva humana. Esta enzima cataliza la hidrólisis rápida, al azar, de los enlaces internos α(1-4). No hidrolizan, en cambio, los enlaces α(1-6) ni la maltosa. Los productos finales de la degradación del glucógeno por la α-amilasa son glucosa, maltosa e isomaltosa. Esta hidrólisis se sigue igual que la ácida, es decir, mediante la reducción de 3’-5’dinitrosalicílico a3-amino-5-dinitrosalicílico (producto coloreado que absorbe a 540 nm).

2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO 2.1. Equipamiento Colorímetro. Baño con agua hirviendo. Agitador de tubos. 2.2. Material Tubos de ensayo de vidrio (1,5 x 16,0 cm) y gradilla. Pipetas automáticas (0,1 y 1,0 mL). Pipetas de vidrio (10 mL). Propipeta. Cronómetro. Rotulador de vidrio. 2.3. Reactivos Solución de ácido clorhídrico.Solución de hidróxido sódico. Reactivo 3´-5´-dinitrosalicílico (3’-5’-DNS). Solución de glucógeno comercial. Solución de α-amilasa de saliva humana. Agua destilada. Solución amortiguadora de fosfato sódico

3. PROTOCOLO A REALIZAR 3.1. Hidrólisis ácida del glucógeno 3.1.1. Se preparan 8 tubos de ensayo de vidrio y se marcan del 1 al 8. Se añaden a cada uno de ellos el glucógeno (excepto al primero quelleva agua) y la solución de HCl según se detalla en la Tabla 1:

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Tabla 1: Hidrólisis ácida Tubo Agua Glucógeno (nº) (mL) (mL) 1 0,4 ---2 ---0,4 3 ---0,4 4 ---0,4 5 ---0,4 6 ---0,4 7 ---0,4 8 ---0,4

HCl (2 M) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

Tiempo de incubación a100ºC 0 min 0 min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 12 min

NaOH (1,2 M) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

3’5’DNS (mL)...