hongos

COLECCIÓN Y AISLAMIENTO DE HONGOS
ENTOMOPATÓGENOS
En condiciones naturales, algunas plagas tienen sus controladores
biológicos específicos que se encuentran presentes en el aire o en el suelo
y se concentran en las proximidades de las plantas afectadas. Entre los
controladores de insectos están los hongos entomopatógenos. Para el
aislamiento de estos hongos, las muestras se colectan en elhábitat natural
del insecto.
Colectar consiste en recoger insectos vivos o muertos, en el follaje, axilas,
tallos, corteza de los árboles, sobre la superficie o en el interior de éstos, en
el suelo, inclusive en crianzas masivas de laboratorio. Si el insecto se
encuentra pegado a una superficie, es necesario cortar la porción del
sustrato que lo contiene y colocarlo en una placa o frasco,pero nunca en
sobre de papel o en medio líquido. El material se conserva mejor si se
mantiene a bajas temperaturas.

Los insectos colectados deben ir con los datos respectivos de:
1. Nombre del colector.
2. Nombre del insecto colectado (familia, género, especie).
3. Lugar (en este caso no es suficiente poner el nombre del área, hay
que incluir el lugar preciso).
4. Hospedante, cultivo oambiente.
5. Altitud.
6. Fecha.
7. Observaciones adicionales (estado del insecto, signo, síntomas,
condiciones climáticas, etc.).
26
Figura 7:
A) materiales utilizados para el montaje de cámara húmeda;
B) muestras colocadas en cámara húmeda.
A
B
27
Figura 8:
Crecimiento del hongo en cámara húmeda, A) vista general y
B) crecimiento del hongo sobre el insecto.
A
B
28
Figura 9:Desarrollo del hongo en medio de cultivo luego del
aislamiento a partir de cámara húmeda.
Una vez en el laboratorio, las muestras son procesadas como sigue (Figura 7):
1. Remojar el insecto en hipoclorito de sodio (0.5% del producto
activo) durante 5 minutos.
2. Enjuagar tres a cuatro veces con agua destilada estéril.
3. Colocar papel de filtro estéril en una caja Petri esterilizada y
agregaragua destilada estéril.
4. Colocar el insecto sobre el papel de filtro dentro de la caja.
5. Sellar la placa con parafilm
®
.
6. Incubar a 20
o
C durante 7 días (Figura 8).
7. Con una aguja de siembra, en la cámara de flujo laminar, tocar
levemente el cuerpo del insecto donde se vea crecimiento
fungoso y transferir su contenido a medio de cultivo (Figura 9).
29
CULTIVOS MONOSPÓRICOS
Paraestablecer una colección confiable, es necesario partir de aislamientos
monospóricos que garanticen la autenticidad y pureza de los mismos y de
los datos que se consigan. Los aislamientos monospóricos pueden ser por
colonia o por punta de hifa (Figura 10).
El procedimiento es como sigue:
1. Sembrar el hongo que se ha aislado directamente del insecto, en
un tubo inclinado con medio decultivo e incubarlo a 20
o
C durante
5 días.
2. Preparar una solución de Tween 80 al 0.1% como sigue:
De la formulación comercial, hacer una dilución al 10%. Tomar
10 ml de Tween 80 y agregar 90 ml de agua destilada. Esta
solución se puede mantener en stock en refrigeración (10
o
C).
Para la preparación del Tween al 0.1%, tomar 1 ml de la solución
al 10% y agregar 99 ml de agua destilada.Esta solución se
esteriliza en el autoclave a 15 libras de presión durante 20
minutos.
3. Preparar una suspensión de esporas, a partir del tubo con el hongo
en desarrollo.
„
„
30
Figura 10:
Procesamiento de cultivos monospóricos, A) materiales
utilizados y B) crecimiento de algunas conidias por placa.
A
B
31
4. En un eppendorf con 1 ml de la solución de Tween al 0.1% colocar
unapequeña porción del hongo y agitar ligeramente para que se
separen todas las esporas.
5. Agitar en un vortex por espacio de 15 segundos y colocar en
bañomaría de ultrasonido durante 3 minutos.
6. Cargar un hematocímetro o cámara de Neubauer y contar el
número de esporas bajo el microscopio de visión plana.
7. Para realizar una segunda dilución, tomar 100 μl de la suspensión
anterior y agregar...