Informe De Laboratorio Bioquímica - Tirosinasa

NOTA 4.0

INFORME LABORATORIO:
extracción de la tirosinasa del banano y determinación de su actividad

Sara Isabel Sanchez Garces
Ana Maria Tobon

Julian Londoño

Bioquimica de los alimentos

Corporacion Universitaria Lasallista
Caldas (Ant)
2012

MATERIALES Y METODOS

Materiales
* 4 tubos de ensayo
* Un mortero pre-enfriado
* Colorímetro
* Buffer fosfato pH 6* Buffer fosfato pH 7.2
* Filtrador
* Sustrato L-Dopa a una concentración de 0.03M
* Banano que no esté en un grado de madurez alto

Para hacer la extracción de la enzima se cogieron 10g de banano, no muy maduro, luego se tritura en un mortero pre-enfriado por que la temperatura ambiente también afecta la temperatura optima (30°C), luego se adicionó un buffer fosfato de un pHde 7.2, se trabajó este pH por qué sirve para inactivar la enzima, ya que el pH óptimo de esta es de 6.5, se necesitaba inactivar la enzima en este momento para que al adicionarle el buffer fosfato para que no sufra una reacción y cambios es las propiedades, luego se filtra el extracto y el filtrado se debe conservar en un baño de hielo. Para medir la actividad enzimática se debe preparar elblanco el cual sería nuestro punto de referencia en el colorímetro, primero cogemos un tubo de ensayo más 1 ml de extracto enzimático, le adicionamos 3ml de buffer fosfato pH 6.0 (para activar la enzima), luego le adicionamos 1ml de agua destilada, cuando el extracto blanco se lleve al colorímetro este debe estar en cero con una longitud de onda de 420nm; luego se debe preparar la muestra quesería nuestro extracto sin inhibidor, se prepara de esta manera en un tubo de ensayo más 1 ml de extracto enzimático, le adicionamos 3ml de buffer fosfato pH 6.0, adicionarle 1ml del sustrato que en este caso sería L-Dopa, inmediatamente llevarlo al colorímetro y leer su absorbancia en 420nm durante 2 minutos en un secuencia de 30 segundos y hacer sus apuntes; para seguir con el procedimiento sedebe preparar la muestra A y B que sería el extracto enzimático con el inhibidor, se toman dos tubos de ensayo a estos tubos se le adicionan 1ml de extracto enzimático a cada uno, luego le adiciono buffer fosfato ph 6, al tubo A le adiciono el inhibidor que sería ácido ascórbico luego le adiciono 1ml de sustrato L-Dopa inmediatamente se lleva al colorímetro, leer su absorbancia en 420nm durante 2minutos en un secuencia de 30 segundos, con la muestra B en la cual tenemos extracto enzimático más buffer fosfato pH 6 y se lleva a un baño hirviendo durante 10 minutos después de que pasen los 10 min le adiciono el sustrato L-Dopa se lleva al colorímetro inmediatamente se lee su absorbancia a 420 nm durante 2 minutos con una frecuecia de 30 segundos; se anotan los datos obtenidos y realizoel análisis.

RESULTADOS OBTENIDOS
La actividad de la tirosinasa en el banano con ácido ascórbico, el extracto enzimático A, de acuerdo a su absorbancia disminuyo en unidades pequeñas con el tiempo ya que el ácido ascórbico actúa correctamente como inhibidor de esta enzima el cual se observó que la enzima más el ácido ascórbico no precipita de ningún color e inactivara el funcionamiento dela enzima. En el extracto enzimático B (enzima más buffer más sustrato más temperatura) se pudo observar que la temperatura desnaturalizo la enzima, la cual pierde su actividad catalítica y desordena la estructura de la enzima. En el extracto enzimático muestra (enzima más buffer más sustrato) se pudo observar que se obtuvo un precipitado amarillo- café, en este caso los valores de absorbanciafueron aumentando con el tiempo.

1.

1. Grafica con los datos obtenidos en el laboratorio con el sustrato L-dopa

2.

2. Grafica de los 5 primeros datos obtenidos en el laboratorio hallando la pendiente. Trabajamos con los 5 primeros datos por que en estos se muestra se muestra una pequeña línea.
Y=mx+b
En la calculadora m=B
Bs=0,0009 sin inhibidor
Bc=0,00003 con inhibidor...