Informe de prácticas de biotecnologia farmaceutica

INFORME DE PRÁCTICAS
DE BIOTECNOLOGIA
FARMACEUTICA:
TECNOLOGÍA DEL DNA
RECOMBINANTE

1. Introducción y objetivo :
El objetivo de esta práctica es clonar un fragmento de DNA genómico obtenidopor
PCR, y transformación en E.coli. Una vez obtenido el clon recombinante dentro de
la bacteria se procederá a su análisis y cuantificación.

2. Material y métodos:
Estrategia seguida para elclonado de DNA genómico obtenido por PCR:
Extracción del DNA genómico: del sedimento celular de la línea SH-SY5Y
derivado de neuroblastoma humano . Para su extracción se utiliza PBS 1X medio
donde seresuspende las células; proteinasaK es una enzima que degrada
proteínas (Histonas) favoreciendo la extracción del DNA genómico y además
degrada una serie de enzimas la endonucleasas (degradan elDNA); Buffer AL
que lisa las células y esto produce la salida de todo el contenido de la célula
incluido el DNA a la solución; un vortex ayuda a mezclar; etanol que hace que
precipite el DNA porquelos ácidos nucleícos, a diferencia de los otros
componentes con los que esta mezclado, no son solubles en etanol. A
continuación se realiza un proceso de purificación del DNA genómico, para ello seutiliza una columna QIAamp Mini la cual tiene una membrana que tiene afinidad
por el DNA, por lo que el DNA se quedara unido a la membrana; buffer AW1 y
AW2 que son de lavado quita todas laimpurezas que puedan estar pegadas al
DNA; y agua estéril que solubiliza el DNA y ya lo tenemos extraído, todos estos
procesos se hacen por centrifugación. La reacción de PCR:, se realizaron tres
PCR laprimera utiliza como molde el DNA genómico que se ha extraído, la
segunda el mismo diluido 10 veces y la tercera el agua que va ser el control
negativo, asimismo las tres PCR utilizan: PCRMix; Cebador44p4 y 44p5 estos
cebadores se emparejan de manera eficiente al molde a una temperatura de
fusión teorica de 66ºC. Analisis de los productos por electroforesis en geles de
agarosa: para separar...