Informe Ibmc Tp1

Introducción a la Biología Molecular y Celular – TP9
Trabajo Práctico Nº 1
Preparación de ADN plasmídico de Escherichia coli

Introducción

Un plásmido es una molécula de ADN circular de doble cadena que no forma parte del genoma del organismo en el que se halla. Este organismo puede ser una bacteria, en el cual se encuentra superenrollado y es de tamaño variable, o en algunas célulaseucariotas. Los efectos de un plásmido son variados: algunos confieren a la célula una o más características que de otro modo la misma no poseería, otros son nocivos para ella.
Si bien la replicación de los plásmidos es autónoma respecto de la del ADN genómico, depende de muchos factores de su hospedador para llevarse a cabo, tales como las enzimas ADN girasa y ADN polimerasa. Durante la divisióncelular segregan azarosamente a las células hijas, lo que hace que su frecuencia en las sucesivas generaciones de células fluctúe con el tiempo. Además, el número de réplicas está regulado por un “represor” que está codificado en el mismo plásmido.
Dos plásmidos son incompatibles si, en ausencia de una presión selectiva, no pueden coexistir debido a la competencia por la maquinaria replicativa yel mecanismo represivo. Uno de los dos conseguirá desplazar al otro y permanecer en la célula.
La utilidad que se les da en la biología molecular tiene que ver con la clonación y el control de expresión de genes bacterianos. Entraremos en más detalles sobre el tema hacia el final del trabajo práctico.

Objetivo

El propósito del experimento llevado a cabo en clase fue la obtención de ADNplasmídico (específicamente, pBluescript II de alto numero de copias) proveniente de una cepa de bacterias de Escherichia coli.

Fundamento del procedimiento

En la primera parte del experimento, ya que aún el mismo no fue terminado, nuestra tarea fue aislar el ADN plasmídico de los demás componentes dentro de la bacteria.
En primer lugar se nos entregó una cepa de bacterias suspendida en unasolución (1) de un sistema buffer, para mantener un pH constante, y un quelante, para secuestrar los cofactores de las enzimas que más adelante podrían degradar el ADN que se busca conservar. Simultáneamente recibimos otras dos soluciones (2 y 3). La segunda solución era alcalina y contenía un detergente iónico. La tercera solución era ácida. Primero mezclamos volúmenes iguales de las soluciones 1y 2, lo que causó la lisis de las bacterias, la desnaturalización de proteínas y ácidos nucleicos y la liberación de lípidos, glúcidos y demás componentes celulares, debido al aumento de pH en el medio. El propósito del detergente era solubilizar los lípidos y contribuir a la desnaturalización proteica, facilitando el futuro acceso al ADN plasmídico. Lo siguiente, luego de cinco minutos deincubación a temperatura ambiente, fue mezclar este sistema resultante con un volumen de la solución 3 igual a los volúmenes de las dos primeras. Esto bajó el pH del medio y ocasionó la renaturalización total del ADN plasmídico (que no se fragmenta gracias a su pequeño tamaño, a diferencia de las grandes moléculas de ADN genómico) y parcial del resto de los ácidos nucleicos y las proteínas, que formaronuna malla blanca entre sí.
Con el objetivo de separar el ADN plasmídico del resto de las moléculas sometimos la muestra a centrifugación durante quince minutos. Como consecuencia obtuvimos un pellet y una capa superior de residuos y, por otro lado, un sobrenadante con el ADN deseado, ARN celular y algunas sales. Éste fue trasladado a otro tubo de Eppendorf al cual añadimos isopropanol que, alser un alcohol con polaridad menor que el agua, disminuyó la solubilidad del soluto, lo que haría más fácil la precipitación en la próxima centrifugación.
De la misma se obtiene el pellet de ADN plasmidico y ARN y un sobrenadante que se descarta. Luego, se procede a lavar el pellet resultante con etanol 70%, alcohol que, debido a su polaridad intermedia permite disolver muchas sales de esta...