informe laboratorio

ACTIVIDA PRÁCTICA
A.- Fraccionamiento subcelular de Hígado
OBJETIVOS
• Conocer las técnicas de homogeneización usadas en el fraccionamiento subcelular.
• Comprender los fundamentos de la técnica de centrifugación usada en el fraccionamiento subcelular.
• Comprender el concepto de moléculas marcadoras y su utilidad en la evaluación del
Fraccionamiento subcelular.
El FraccionamientoSubcelular comprende dos etapas, una primera etapa de ruptura u
homogeneización y, una segunda etapa de fraccionamiento propiamente tal. El fraccionamiento o separación de los distintos componentes celulares se realiza mediante una serie de centrifugaciones sucesivas, las que sedimentan los diferentes organelos en un campo gravitacional dependiendo de sumasa y tamaño.
Al centrifugar una muestra seobtienen dos fases claramente definida: el pellet que corresponde al sedimento propiamente tal y el sobrenadante, que corresponde a la fracción líquida que permanece sobre el material sedimentado.
El pellet obtenido corresponde a los organelos que han sedimentado, éstos se resuspenden y se guardan para el resto de los análisis bioquímicos, mientras que el sobrenadante se vuelve a centrifugar. Laetapa de ruptura y homogeneización de la muestra se realiza colocando el tejido fresco a fraccionar y una cantidad adecuada de solución tampón, la que deja los organelos en suspensión y sirve para que no se rompan durante el fraccionamiento en un homogeneizador. Todo el proceso se realiza
además en frío (4ºC) para evitar una posible degradación de las estructuras celulares y así conservar intactas lamayor parte de las características funcionales originales del organelo que se pretende aislar.

EXPERIME_TO _º 1
Usted recibirá un homogenizado filtrado, preparado por sus profesores, el cual se obtuvo de la siguiente manera:
1. Dejar en inanición una rata una noche antes del experimento.
2. Matar un ratón adulto (cerca de 30 g) por dislocación cervical y rápidamente extraer el hígado desdela cavidad peritoneal (descartar la vesícula biliar). Dejar el hígado en 50
ml de Buffer IBc frío en un pequeño vaso.
3. Dejar el hígado libre de sangre usando IBc frío. (Usualmente entre 4 y 5 clarificaciones es suficiente)
4. Picar el hígado en pequeños pedazos utilizando tijeras. Esto podría ser realizado mientras se mantenga el vaso en una fuente con hielo.
5. Descartar el IBc usadodurante picado y reemplazarlo con 5 ml de IBc frío fresco y transferir la suspensión al tubo de homogenizado (mortero) y operarlo a 1600 RPM mezclando de 3 a 4 veces.
Recordar:
• A 4ºC se minimiza la activación de daño generado por fosfolipasas y proteasas.
• El radio optimo entre el tejido y el buffer de aislamiento es de 1:5 a 1:10
(peso:volumen)
• Enfriar el tubo de homogenizado en hielo por 5minutos antes de iniciar el procedimiento.
6. Trasferir el homogenizado a un tubo Falcon de polipropileno y centrifugar a 600 g (2500
RPM app.) por 10 minutos a 4ºC.
7. Transferir el sobrenadante a tubo de centrifugación y centrifugar a 7000 g (6000 RPM app.) por 20 min. a 4ºC.
8. Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 5 ml de IBc frío.
9. Centrifugar a 7000 g (6000 RPM app.) por 20min. a 4ºC.
10. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet conteniendo mitocondrias en 1 ml de IBc.
11. Trasferir la suspensión mitocondrial en un tubo Falcon y guardar en hielo.
Recordar:
• Minimizando la exposición al oxigeno se puede mantener la funcionalidad de la porción mitocondrial
por largo tiempo.
• Es recomendable utilizar esta preparación mitocondrial entre 1 a 3 horas post.aislamiento.
12. Medir la concentración mitocondrial utilizando el método de Biuret (o de Bradford, pero el lisado mitocondrial se diluye en order al punto de saturación de la prueba).
Recordar:
• La concentración usual de mitocondrias en este tipo de preparación es de cerca de 80
mg/ml y el volumen total es de 1 ml.

EXPERIME_TO _º 2
En un portaobjetos limpio y seco coloque una gota de...