Informe purificacion lisozima de clara de huevo de gallina

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  • Publicado : 14 de diciembre de 2010
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Purificación de lisozima
Introducción:
La lisozimas son un conjunto de proteínas de bajo peso molecular (14 – 30 KDa) que son estable a pH acido y son proteínas básicas (su punto isoeléctrico es elevado 10.5-11)
Son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos β (1-4) de los polisacáridos de la pared celular bacteriana y que se encuentran presentes en secreciones humanas y enotros vertebrados, invertebrados, bacterias, virus y plantas. Debido a que se encuentra en tantos organismos diferentes y a su capacidad lítica, se considera a la lisozima como una de las enzimas pertenecientes al sistema de inmunidad innata. Un sistema de defensa inespecífico y primitivo
En nuestro caso realizamos una purificación de lisozima presente en la clara de huevo de gallina.
Nuestroobjetivo es proponer un método para purificar la lisozima y realizar una comparación entre dos métodos: una cromatografía de intercambio iónico y una cromatografía de penetrabilidad.

Materiales y métodos:

Materiales:
Biológicos:
• Un huevo de gallina
Reactivos:
• Reactivo de Bradford (BioRad)
• Paredes bacterianas de Micrococcus lysodeikticus (0.3 mg/mL en tampón fosfato 0.1 M,pH 6.6
• Albúmina de suero bovino (BSA) 1 mg/mL
• Tampones fosfato.
• Muestra de azul de dextrano y ferricianuro potásico para equilibrar la cromatografía en Sephadex
Para realizar la purificación extraímos la muestra inicial separando la clara y la yema de un huevo de gallina.
Primero se sometió la muestra a una dilución en tampón fosfato y un homogeneizado por filtración através de una gasa doble.
Se tomó como volumen inicial de muestra de 16 mililitros y se centrifugó a 4500 revoluciones por minuto durante 5 minutos.
Se tomó el volumen de sobrenadante (E1) y se sometió a un tratamiento térmico, primero sometiéndolo a un baño en agua a 60ºC durante 5 minutos y luego enfriando en baño de hielo durante 5 minutos.
Se sometió de nuevo la muestra a centrifugación con lasmismas características que la primera (4500 rpm, 5 min)
Se volvió a tomar el sobrenadante (E2) ya que la lisozima al ser termoestable no precipitará.
De estas dos primeras etapas (E1 y E2) se tomó una muestra de 1 mililitro después de cada centrifugación y después de haberse medido el volumen total de sobrenadante para realizar con ellas las valoraciones de proteínas, ensayar la actividadenzimática y analizar su nivel de purificación en electroforesis.
Como tercer paso en esta purificación de lisozima se realizaron 2 cromatografías diferentes. Una de intercambio iónico en Amberlita (matriz de poliestireno entrecruzado con acido metacrílico. Intercambiador de cationes, débilmente acido) y otra de penetrabilidad en gel de Sephadex G-75 (polímero de dextrano cuyo intervalo defraccionamiento de proteínas globulares es: 3000-80000 Da).
En nuestro caso se realizó la cromatografía de intercambio iónico en una columna de vidrio con un diámetro de 3 centímetros. Se adicionó la resina hasta una altura de 3 centímetros. Inicialmente equilibramos la columna con tampón fosfato potásico 01 M, pH 6.6.
Se cargó como muestra el volumen de E2 al que se añadieron 2 mililitros de tampón fosfatopotásico (1M, pH 6.6) por cada 10 mililitros de volumen de extracto.
Una vez cargada la muestra se lavó la columna con tampón fosfato potásico 0.1M pH 6.6 y se eluyó con tampón fosfato potásico 0.6M, pH 6.6. Para el lavado se recogieron fracciones de 10 mililitros y para el eluido de 3 mililitros.
A continuación se midió la absorción de todas las muestras a 280 nanómetros para detectar loslugares donde existía proteína.
Una vez identificadas las fracciones que contienen proteína se realizo un ensayo enzimático empleando paredes bacterianas de Micrococcus lysodeikticus para detectar las fracciones que poseen una mayor actividad y por tanto mayor cantidad de enzima. Todo el ensayo se realizó a 25º C en tampón fosfato 0.1 M pH 6.6. El tiempo que se empleó para cada ensayo fue de 3...
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