Aislamiento y purificación de lisozima de huevo de gallina

PURIFICACIÓN DE ENZIMAS: AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE LISOZIMA

ÍNDICE

1. Índice …………………………………………………… 1

2. Introducción……………………………………………….. 2

3. Materiales y métodos …………………………………. 2

4. Resultados ……………………………………………... 2-5

5. Discusión de resultados ………………………………. 5

6. Conclusiones …………………………………………... 6

7. Bibliografía ……………………………………………... 6

1.INTRODUCCIÓN

Lisozima

Se conoce por lisozima o muramidasa ( péptidoglicano N-acetil-muramil hidrolasa EC 3.2.1.17) a los componentes de un conjunto de enzimas cuya función característica es hidrolizar los enlaces β-glicosídicos (1-4) presentes entre los residuos de N-acetilglucosamina (NAG),y N-acetilmurámico (NAM), principales determinantes de la estructura tridimensional de la paredcelular bacteriana. Su actividad bacteriolítica fue descrita en 1922 por Fleming (1).Su actividad óptima tiene lugar a pH 5.37-6.72 y Tª 25-55º C.
La lisozima está presente en lágrimas, mucus nasal, plasma sanguíneo y en otras secreciones y tejidos.
La más estudiada es la lisozima de clara de huevo de gallina, que se caracteriza por tener una cadena polipeptídica de 129 aminoácidos (14,6 kD) concuatro enlaces disulfuro (2).

Objetivos

El objetivo principal de esta práctica experimental es encontrar el método que permita purificar la lisozima presente en la clara de huevo de la forma más eficiente, recogiendo los datos obtenidos en cada una de las etapas de la purificación para su posterior comparación, buscando en último lugar posibles mejoras en el método de purificación realizado.MATERIALES Y MÉTODOS

Material biológico

* Huevo de gallina
* Paredes de Micrococcus lysodeikticus

Métodos

La práctica a realizar consta de varios pasos con los que se va a obtener la lisozima presente en la clara de un huevo de gallina de la forma más purificada posible.
Se prepara el extracto enzimático, separando la clara de huevo, y se realiza un primertratamiento ácido, aplicando a la lisozima ácido acético 0,1 M. De esta primera operación y tras una centrifugación se forma un precipitado constituido por algunas proteínas que se han desnaturalizado.
Posteriormente se realiza un tratamiento térmico, donde el sobrenadante recogido se calienta a 60ºC y se deja enfriar en un baño de hielo. Se centrifuga y se recoge el sobrenadante, que es donde seencuentra la lisozima. Se toma un mililitro de cada una de las muestras y se guardan.
Luego se realizan de modo comparativo dos cromatografías: una cromatografía de intercambio iónico, con Amberlita y otra cromatografía de penetrabilidad, con Sephadex. Los máximos de absorbancia medidos a 280 nm permiten identificar la posición de la lisozima en el perfil de elución.
La medida de la actividad enzimáticase lleva a cabo mediante el método de Morsky (3), que consiste en la hidrólisis de paredes bacterianas de Microccocus Isodeikticus, a partir de los tubos de elución con mayor absorbancia a 280 nm. E3 se elabora con los tubos de elución con mayor actividad.
La determinación de la concentración de lisozima en cada uno de los extractos recogidos, E1, E2 y E3, se llevó a cabo con BSA como proteínapatrón mediante el método de Bradford (4)
Por último, se realiza una electroforesis en gel de poliacrilamida y en presencia de SDS, a partir de la cual se elabora una nueva recta de calibrado con las masa moleculares de las proteínas patrón y las distancias migradas en el gel separador, con el fin de conocer si las muestras purificadas contienen contaminantes.

RESULTADOS

En el tratamientoácido y térmico de la disolución de clara de huevo se obtuvieron respectivamente 15,2 ml (E1) y14,3 ml (E2).
Tras la cromatografía de intercambio iónico se elaboró un cromatograma (Figura 1) donde se identificaron dos picos, el primero con tampón fosfato 0,1 M pH 6,6 y el segundo con tampón fosfato 0,6 M pH 6,6. Con las medidas de absorbancia a 280nm de las fracciones más significativas (Figura...