Ingeniería de células madre pluripotentes humanos por aav mediada por recombinación homóloga 

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  • Publicado : 20 de agosto de 2012
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Ingeniería de células madre pluripotentes Humanos por AAV mediada por recombinación homóloga 

la manipulación genética exacta de las células madre pluripotentes tendrá que darse cuenta de su potencial científico y terapéutico. Aquí, mostramos que los vectores de virus adeno-asociados (AAV) génica puede ser utilizado para modificar genéticamente células madre embrionarias humanas (CES) ycélulas madre pluripotentes inducidas (CMPi). Diferentes tipos de cambios específicos de secuencia, incluyendo la creación y corrección de mutaciones, se introdujeron en el ser humano y HPRT1 HMGA1 genes (mutaciones HPRT1 ser responsable del síndrome de Lesch-Nyhan). Mutagénesis dirigida se produjo a altas frecuencias, tanto en los CES y CMPi, con más de 1% de todas las unidades formadoras de colonias(UFC) sometidos a la focalización en algunos experimentos. vectores AAV también podría ser utilizada para combatir los genes en fibroblastos humanos que fueron utilizados posteriormente para obtener CMPi. Precisa y eficiente focalización se llevó a cabo con la citotoxicidad mínima o nula, y la mayoría de las células madre específicas de genes se produce euploid y pluripotentes. 
Introducción 
Lascélulas madre embrionarias (CME) es un atractivo sistema de mutagénesis dirigida por su capacidad de proliferar indefinidamente in vitro. El descubrimiento de que una célula somática puede representar pluripotentes por la expresión ectópica de cuatro transcripción factores1, 2 amplía enormemente la disponibilidad de células madre pluripotentes y trae la promesa en el campo de la medicinapersonalizada.Varios estudios han reportado éxito gen focalización en las células madre pluripotentes. Cuando transfectar o electroporating la plásmido basado en construcciones, 1 en 106 o menos células sufren orientación ,3-7, haciendo de esta una forma ineficaz. Orientación de frecuencias se puede aumentar de manera significativa por el uso de las nucleasas de dedos de zinc con un sitio específico (ZFNs),8-10, pero esta estrategia requiere un diseño personalizado nucleasa y puede causar desviado de corte y genotoxicidad. Por lo tanto, hay una necesidad de un método eficaz y no tóxico orientación aplicable a cualquier locus genético. Virus adeno-asociado (AAV) vectores tienen un genoma monocatenario lineal y puede ser utilizado para introducir una gran variedad de mutaciones específicas en locihomólogos cromosómicas en hasta un 1% de lo normal humanos cells.11-13 A continuación, se muestra que AAVvectores puede ser utilizado para el gen eficiente y versátil focalización en las células madre pluripotentes, así como las células de las que se derivan. 

Mteriales y métodos
La CULTIVO de la célula. CMPi Humanos y de los CES se cultivaron en fibroblastos de ratón irradiados embrionariasderivadas de la progenie del DR-4 mice42 cruzados con ratones CF-1 (Charles River Laboratories, en Wilmington, MA) en medio DMEM/F12 complementado con el reemplazo de 20% de suero golpe de gracia (KSR) , solución al 1% de aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1%, 0,1 mmol / l β-mercaptoetanol, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 2 ng / ml de factor básico decrecimiento de fibroblastos (CES medio) según lo descrito, un todos los obtenidos de Invitrogen (Carlsbad, CA). MHF2 fibroblastos normales macho humano (n º GM05387; Coriell Instituto de Investigaciones Médicas, Camden, New Jersey) y fibroblastos de Lesch-Nyhan (n º GM20393; Instituto Coriell para la Investigación Médica) fueron cultivadas en DMEM con 10% inactivado por calor suero fetal bovino (HyCloneLaboratorios, Logan, UT), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 1,25 mg / ml de anfotericina. La osteogénesis imperfecta MSC (OI12) se establecieron a partir de los fragmentos vertebrales de un paciente de 15 años de edad con OI tipo III obtenidos durante la cirugía correctiva en virtud de Revisión Institucional de aprobación de la Junta como se describió anteriormente....
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