ingenieria de procesos

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03/04/2013 v4
Análisis de restricción del plásmido pYNR ex LEU2
Endonucleasas de restricción
Son enzimas que reconocen secuencias cortas en el ADN y lo cortan, en esas mismas secuencias o
adyacentes a ellas. Se han descubierto aproximadamente 3000 enzimas de restricción que reconocen
más de 230 secuencias distintas de ADN. La mayoría han sido encontradas en bacterias, aunque también
hansido aisladas de virus, arqueas y eucariotas.
Principalmente son usadas para modificar in vitro el ADN así como para realizar patrones de restricción
de un determinado fragmento de DNA.
Digestión pYNR ex LEU2 (10 μl)
pYNR ex LEU2
Tampón enzima
Enzima restricción
H 2 O mQ

[ ] stock
300 ng/μl
10X
5 U/μl
(hasta 10 μl)

[ ] reacción
30 ng/μl
1X
(1 U)

vol
1 μl
1 μl
0.2 μl
7.8μl

En esta práctica utilizaremos las enzimas EcoRI y XhoI (cortan dos veces).
pYNR ex LEU2 (Perdomo et al., 2002)
Este plásmido fue diseñado el lab. del Prof. Siverio, por el hoy Prof. Germán Perdomo (Universidad
Castilla la Mancha) para la producción de proteínas en la levadura Hansenula polymorpha. Su secuencia
contiene los elementos siguientes:
R

· amp : codifica una β-lactamasa queconfiere resistencia a ampicilina que permite seleccionar el
plásmido durante su manipulación en bacterias.
· LEU2: codifica la β-isopropilmalato deshidrogenasa, que complementa las cepas auxotróficas para la
síntesis de leucina (leu2), permitiendo seleccionar los clones de la levadura que han incorporado el
vector.
· pYNR1 y tYNR1: promotor y terminador del gen de la nitrato reductasa de lalevadura H. polymorpha,
respectivamente. Éstos permiten la inducción y correcta expresión de un gen foráneo en la levadura H.
polymorpha en presencia de nitrato.
Además, contiene una región para clonaje múltiple que contiene dianas únicas en el vector y permite
insertar el gen de la proteína que se quiere expresar.

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Electroforesis en gel de agarosa
Es una técnica que permite laseparación de moléculas cargadas debido a su diferente movilidad en un
campo eléctrico a través de un gel de agarosa. En el caso del DNA la relación carga/masa es constante y
las moléculas de DNA se separan en función del tamaño. Hay otros factores que influyen en la movilidad
de una molécula en un campo electroforético como son la forma de la molécula o la concentración de
agarosa del gel.
El equipo ylos reactivos necesarios para la realización de una electroforesis en gel de agarosa son
relativamente simples e incluyen:
· Cubeta de electroforesis y una fuente de alimentación
· Bandejas para preparar los geles, disponibles en varios de tamaños y compuesto por plástico
transparente a los rayos UV. Los extremos abiertos de las bandejas se cierran mientras que el gel está
polimerizando, yluego quedarán expuestos durante la electroforesis.
· Peine para formar pocillos donde se cargarán las muestras.
· Tampón de electroforesis, por lo general Tris-acetato-EDTA pH 8.2 (TAE) o Trisborato-EDTA (TBE).
· Tampón de carga, que contiene una sustancia densa (e.g. glicerol) para que caiga
en los pocillos, y uno o dos colorantes, para poder seguir el desarrollo de la
electroforesis. Eneste caso, está diez veces concentrado (10X).
· Marcadores de masa molecular (expresados en pares de base), para poder estimar
el tamaño y la concentración de las muestras. En este caso, fago λ digerido con
BstEII (ver esquema de la derecha).
· Agente intercalante fluorescente, que se une a los ácidos nucleicos y facilita su
visualización. NOTA: estos agentes deben ser manipulados como unproducto
químico peligroso – usar guantes. Usaremos GelRed™.
· Transiluminador, que se usa para visualizar el ADN teñido en los geles. NOTA: usar
siempre protección para los ojos cuando se observa ADN en un transiluminador
para evitar daño en los ojos por la luz UV.

8450
7240
6360
5680
4820
4320
3670

2320
1920

1370
1260

700

Gel de electroforesis 1%
Agarosa
TAE (1X)...