Ingenieria genetica

Ingegneria genetica

Modificazione dell’ingegneria genetica di un organismo attraverso la deliberata manipolazione del suo materiale genetico.


Ricerca di base: purificare, esprimere, amplificare geni.

Utilizzata

Ricerca applicata/commerciale (biotecnologie): sviluppo microrganismiingegnerizzati per la produzione di specifiche sostanze (ormoni, vaccini,
farmaci, proteine).

Per poter manipolare un gene è necessario CLONARLO: isolarlo, purificarlo e farlo esprimere (ovvero tradurlo in un sistema più comprensibile per l’operatore).
Gli strumenti dell’ingegneria genetica sono:
1. Vettori diclonaggio (utilizzati per portare le sequenze di DNA in batteri ricettivi e per amplificare la sequenza desiderata) sono i plasmidi. Servono per inserire DNA esogeno al loro interno e al tempo stesso essere in grado di replicarsi nella cellula ospite.
I vettori plasmidici sono pUC, pBR 322, pGEM e sono formatida circa 20 Kb;
i batteriofagi, come lambda, costituiti da circa 25 Kb;cosmidici costituiti fino a 45 Kb.
2. Enzimi di restrizione servono per tagliare in modo riproducibile il DNA da amplificare in punti precisi allo scopo di inserirlo nei vettori (sono le endonucleasi di restrizione).
Riconoscono sequenze specifiche di DNA che sono rappresentate da 4-5 basi e tagliano solo quando ci sono questi indicatori. I siti di taglio sono specifici e si hanno solo inpresenza di una sequenza 5 basi.
3. DNA ligasi: è il processo inverso in grado di unire molecole lineari di DNA riformando l’unità della catena nucleotidica.



Vettori di clonaggio



▪ Piccole, ben caratterizzate molecole di DNA;
▪ Contengono almeno un sito d’inizio (ori) replicazione nell’ospite prescelto;
▪ Contengono uno o piùgeni che ne consentano l’identificazione;


PLASMIDICI:

▪ Replicano indipendentemente;
▪ Piccole dimensioni;
▪ DNA circolare (stabile durante la manipolazione);
▪ Multiple copie per cellula;
▪ Trasportano geni per la resistenza agli antibiotici;
▪ Introdotti in batteri mediante trasformazione/elettroporazione (costosa, solo per alcuni batteri);
▪ Rimosso operone tra;
▪ Siti perazione endonucleasi di restrizione (siti di taglio per gli enzimi, detto sito di policlonaggio – multiple cloning site). Danno le estremità a cui far aderire il DNA da clonare.



Gli enzimi di restrizione (endonucleasi): riconoscono una sequenza sitospecifica nelle molecole di DNA se:
- taglio sfalsato nella molecola di DNA generano estremità coesive (stikcy ends); è più facilel’inserimento;
- taglio non sfalsato nella doppia elica di DNA generano estremità piatte (blunt ends); non c’è
l’appaiamento delle basi e il plasmide non tende a richiudersi. L’opera delle ligasi è più
complicata.

Un gene non viene manipolato direttamente (per esempio un gene costituisce lo 0.05% del genoma E. coli), ma si utilizzano dei passaggi intermedi per aumentarne la quantità efacilitarne la manipolazione >>clonaggio.
1) Isolamento e frammentazione DNA.
2) Introdurre frammento desiderato.
3) Introdurre e mantenere il frammento clonato in ospite intermedio.
4) Identificare e purificare il clone desiderato.
5) Produrre grandi quantità di gene clonato per studiarlo.


























L’uso di enzimi di restrizione non è sufficienteper clonare un gene.
Quando le sticky o blunt ends create dagli enzimi di restrizione sono allineate si formeranno solo dei legami idrogeno tra le basi appaiate e non saranno sufficienti a mantenere l’integrità del DNA.
È necessario ricostruire la continuità dello scheletro della molecola di DNA utilizzando una DNA ligasi.





TRASFORMAZIONE E SELEZIONE


Dopo aver ottenuto il DNA...