Inmunologia

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REACCIONES DE PRECIPITACIÓN SOBRE GELES Corresponde a una forma de visualización de moléculas que precipitan en un medio semisólido como el gel de almidón, agar, agarosa, poliacrilamida, etc. Revisaremos en primer lugar las reacciones para visualizar una electroforesis y luego algunas reacciones para visualizar reacciones Ag-Ac como la inmunoelectroforesis, inmunodifusión radial,electroforesis en cohete. 1) Electroforesis. El término electroforesis (EF) se usa para referirse a la migración de moléculas o partículas ionizadas bajo la influencia de un campo eléctrico. Las aplicaciones más difundidas –pero no exclusivas– son la separación de mezclas de proteínas y de ácidos nucleicos. El proceso electroforético se lleva a cabo sobre un soporte inerte que puede ser papel denitrocelulosa, gel de agar, agarosa, almidón o poliacrilamida los cuales son tamponados a un pH requerido. La separación depende esencialmente de la carga neta de las moléculas –influenciada por el pH del buffer– y es independiente del tamaño, con excepción de la electroforesis realizada sobre una gradiente de poliacrilamida, en la cual al aumentar la concentración del gel disminuye la separación entre lasmoléculas del soporte impidiendo el paso a moléculas de mayor tamaño, en consecuencia este tipo de electroforesis permite la separación en función de la carga y tamaño molecular. Electroforesis en gel de agar. Ha sido utilizada ampliamente en el estudio de las proteínas plasmáticas y otros líquidos biológicos, desde el punto de vista de la utilidad clínica sirve para tener una visión global delestado de las fracciones proteicas y si estas se encuentran en concentraciones normales, aumentadas o disminuidas. Tiene especial utilidad para detectar proteínas anormales (paraproteínas) como las proteínas monoclonales del mieloma múltiple y otras gammapatías. Se utiliza un gel de agar purificado o de agarosa de bajo efecto electro-endosmótico al 1 % en buffer adecuado, en el caso del estudio deproteínas séricas se usa un pH 8.6 ya que las proteínas séricas tienen puntos isoeléctricos (P.I.) inferiores con excepción de las γ globulinas que tienen P.I. 8.6 razón por la cual a este pH tienen carga neta cero y no migran en la electroforesis, aunque un ligero y generalmente deseable desplazamiento hacia el polo negativo es posible gracias al efecto electroendosmótico. Este tipo de EF tiene unaresolución que permite visualizar 5 a 6 fracciones. Desde el polo positivo o frente de migración estas son la Albúmina, globulinas α1, globulinas α2, β globulinas y γ globulinas, en esta última fracción se encuentran la mayoría de los Acs (Fig.1) y se conoce también como fracción de las inmunoglobulinas. A veces se observa una fracción β2 a continuación de la fracción β y una fracción de prealbúmina antes de la banda de albúmina.

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La electroforesis cualitativa suele ser suficiente, pero se puede cuantificar a) cortando y eluyendo las bandas en una solución ligeramente alcalina (Ej. NaOH 0.01 N) y leyéndolas espectrofotométricamente para obtener la absorbancia y concentración relativa o porcentual de cada fracción, o b) en un aparato llamado densitómetro que lee, grafica einterpreta en función de la intensidad de la coloración después de teñir. Para ello el densitómetro utiliza una adaptación de la espectrofotometría.

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa de proteínas del suero. A) Patrón de electroforesis normal de proteínas séricas. B) Fracciones de las diferentes proteínas séricas.

El resultado de la electroforesis puede ser influenciado por varios factores atener en cuenta, tales como: • Naturaleza del soporte. Debe ser inerte con mínima adsorción de proteínas, tamaño del poro adecuado, por ejemplo: el papel ya no es útil por lento y poco resolutivo, mientras que el agar y acetato de celulosa presentan características parecidas aunque el primero es más usado, y el gel de poliacrilamida tiene gran poder de resolución (más de 25 bandas) pero no se...