Investigacion

Curso: Introducción a la Bioinformática

Introducción al diseño de primers
INTRODUCCIÓN Esta guía es una breve aproximación al diseño de primers, utilizando programas bioinformáticos y pretende dar una orientación a aquellas personas que están incursionando por primera vez en esta amplísima disciplina que es la Bioinformática. Si esta guía orienta y ayuda al científico a realizar sus propiosprimers o cebadores, ha logrado su cometido. En la primera parte de esta guía, revisaremos algunos conceptos generales pertinentes al diseño de primer y a la amplificación enzimática de ADN mediante PCR, y en la segunda se detalla un taller que le permitirá poner en práctica la mayoría de los conceptos revisados. PARTE I Fundamentos teóricos de la amplificación enzimática de ADN mediante laReacción en Cadena de la Polimerasa (PCR; polymerase chain raction) La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica que ha revolucionado el modo de manipular, clonar y detectar fragmentos de ADN, lo que le ha valido a su descubridor K. B. Mullis el Premio Nobel. Después de su descubrimiento en 1983, se ha convertido en una de las técnicas básicas de Biología Molecular, ampliamente utilizada debido asu rapidez, especificidad, flexibilidad y aplicabilidad. Entre sus aplicaciones generales encontramos la generación de sondas, clonación, secuenciación, diagnóstico clínico y tipificación de individuos y microorganismos, siendo entonces muy utilizada en medicina forense y en estudios filogenéticos. Un ciclo de PCR comienza con un calentamiento inicial que desnaturaliza el ADN blanco a 94-95 °C omás. Este primer paso del ciclo dura en promedio 90 s a 3 minutos. En el proceso de desnaturalización, las dos cadenas del ADN se separan una de la otra y permiten que la matriz (“template”) se encuentre como cadena simple, necesaria para la actividad llevada a cabo por la polimerasa termoestable durante los pasos de amplificación. En el siguiente paso del ciclo, la temperatura se reduce a unvalor que oscila en el rango de los 40 °C a los 60 °C. A esta temperatura, cada uno de los oligonucleótidos (primers) hibrida con la secuencia complementaria en cada una de las cadenas simples de ADN, que se han separado en el paso anterior, y sirven como cebadores para la síntesis, por la polimerasa termoestable. La síntesis de ADN se inicia cuando la temperatura de la reacción llega al valor óptimopara la actividad de la polimerasa. Para la mayoría de las polimerasas esta temperatura se encuentra en, aproximadamente los 72 °C. Luego se permite la síntesis durante 30 s a 2 min. Este paso completa un ciclo y el siguiente ciclo se inicia con el retorno a los 94-95 °C para la desnaturalización. La cantidad de amplificado resultante va a depender de la disponibilidad de sustrato para la reacciónpor eso, los oligonucleótidos y los desoxirribonuclótidos trifosforilados se
Lic. en Genética Ernesto Martín Giorgio

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añaden en exceso respecto al ADN a amplificar. Como es fácil inferir, la concentración de ADN, oligonucleótidos, de y ADN polimerasa activa disminuyen después de cada ciclo debido a la síntesis que se está produciendo por lo quela reacción lleva a un máximo de amplificación, luego del cual el rendimiento y el número de copias obtenidas no aumentan. A esto se lo conoce como el efecto “Platteau”. En la reacción de PCR ideal, existen tres fragmentos de ácidos nucleicos. El fragmento de ADN de doble cadena a ser amplificado (molécula blanco o target) y dos oligonucleótidos de cadena simple que hibridizan en alguna región delADN blanco (iniciadores o primers). Además están presentes: un componente proteico (la enzima ADN polimerasa), desoxirribonucleótidos trifosfatos (dATP, dCTP, dTTP y dGTP), buffers y sales. Los primers se añaden en un vasto exceso comparado con el ADN blanco a ser amplificado. Estos se hibridizan a las cadenas opuestas del blanco y se orientan enfrentándose con sus respectivos terminales 3’,...