Lab proliferacion celular

Objetivo del trabajo

Analizar la proliferación celular en cortes de tejido endometrial, a través de la inmunodeteccion del antígeno nuclear Ki67, el cual se expresa exclusivamente en las célulasque entran al ciclo celular (G1, S, G2 y Mitosis).

Materiales

Cortes de tejido endometrial
Cámara húmeda
Micropipetas
Puntas
Tubos

Reactivos

Fosfato buffer salino (PBS)Anticuerpo secundario biotinilado
Estreptavidina-Peroxidasa
Cromógeno (diaminobencidina)
Hematoxilina

Metodología

Pasos previos:

1.
Las muestras de tejido endometrial se fijan en formalinabufferada al 10% y se incluyen en parafina, para obtener un sólido apto para hacer los microcortes. Luego de hacer los cortes de 5 μm, se colocan en portaobjetos pre-tratados con silano para obteneruna mejor adherencia del tejido a la placa (debido a que la técnica inmunohistoquímica es muy agresiva para los tejidos). Luego, los portaobjetos se colocan en una estufa a 60°C por 60 minutos.Posteriormente se requiere de una desparafinización, que se realiza con Xilol durante 10 min, para lograr exponer a los antígenos de la célula y así poder ser reconocidos. Luego se Hidrata con etanol.Para recuperar los antígenos, se utiliza Buffer Citrato de Sodio 10mM durante 20min a 95°C.
Luego se bloquea la peroxidada endógena incubando con peróxido de hidrógeno al 10% durante 5 min.
Parabloquear los sitios inespecíficos, se realiza una incubación con albúmina sérica bovina al 4% en PBS.
Finalmente, se realiza la incubación con el anticuerpo primario, anti-Ki67 (1:100) durante 30 min aT° ambiente. Donde uno de los cortes se utiliza como control negativo incubando con el buffer de dilución del anticuerpo primario (en ausencia de dicho anticuerpo).
Pasos a realizar en el día deltrabajo práctico:

Al iniciar el trabajo práctico, se toman los tejidos y se someten a 3 lavados de 3 minutos cada uno con PBS para limpiar los tejidos de cualquier tipo de residuo anterior....