Lacteos

MATERIALES
• Huevos de gallina para la obtención de la enzima.
• Tampón A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10
• Tampón B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 0.6 M NaCl
• Carboximetil-CelulosaActivación de la CM: previamente a su utilización, la resina se lava con HCl 0.5 M (5
minutos), 2 veces con H2
O (hasta pH neutro), NaOH 0.5 M (5 minutos) y finalmente dos
veces con H
2
O(hasta pH neutro). Por último se hace una suspension 1/1 (vol/vol) en
tampón glicina/NaOH 100 mM pH 10
• Tampón fosfato sódico 100 mM, pH 6,2
• Suspensión de la bacteria Micrococcus Lvsodeikticus 20mg en 100 ml del tampón fosfato.

METODOS
A. PURIFICACION DE LA LISOZIMA
1. Recoger la clara procedente de un huevo. Diluirla 1/5 (vol/vol) con tampón A. Tomar 10
ml de la muestra anterioren un tubo cónico con tapón de 15 ml.
2. Antes de comenzar la purificación de la lisozima separar una alícuota de 1 ml para medir
la actividad de la enzima en la fracción de partida.
3. A los 9ml restantes (Fracción O, Fo), añadir 5 ml de CM-celulosa previamente activada y
agitar suavemente durante 15 min, para que la lisozima se adsorba a la resina.
4. Al finalizar la incubación,centrifugar la muestra a 1500 ×g durante 5 min. Guardar el
sobrenadante (Fracción 1, F
1
).
5. Añadir a la resina (precipitado) 10 ml de tampón A. Agitar suavemente y centrifugar de
nuevo. Recogerel sobrenadante (Fracción 2, F
2
).
6. Repetir el lavado anterior y desechar el sobrenadante.
7. Elución. Resuspender la CM-celulosa con 3 ml de tampón B e incubar, agitando
suavemente, durante10 minutos. Centrifugar y recoger el eluído (Fracción 3, F
3
, lisozima
purificada).
Medir, exactamente, en tubo cónico graduado el volumen total de cada fracción
MATERIALES
• Huevos degallina para la obtención de la enzima.
• Tampón A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10
• Tampón B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 0.6 M NaCl
• Carboximetil-Celulosa
Activación de la CM:...