LCIII Practica 4 Electroforesis

Electroforesis de proteína de la leche (caseína) en gel de poliacrilamida

Daniel Camacho1, José Mar Perez1, Saúl Saavedra1, Gabriel Vigueras2,*

1Licenciatura en Ingeniería Biológica, División de Ciencias Naturales e Ingeniería Universidad Autónoma Metropolitana-Cuajimalpa, Artificios No. 40, 6° Piso Col. Hidalgo
Álvaro Obregón, C. P. 01120 México, D. F.

2Departamento de Procesos yTecnología, División de Ciencias Naturales e Ingeniería Universidad Autónoma Metropolitana-Cuajimalpa, Artificios No. 40, 6° Piso Col. Hidalgo
Álvaro Obregón, C. P. 01120 México, D. F.
*jvigueras@correo.cua.uam.mx

Palabras clave: (electroforesis, poliacrilamida, caseina, proteina.)

Introducción
La electroforesis es una técnica empleada para la separación de moléculas como ADN, ARN y proteínas. Permitela separación a lo largo de un campo eléctrico en función de su tamaño, su carga eléctrica y algunas otras propiedadesi.
físicas. Entonces utiliza para migrar partículas cargadas, a través de un campo eléctrico. En el caso de la electroforesis en gel consiste en aplicar una corriente eléctrica, para que las moléculas atraviesen una placa de gel.

Existen diferentes geles dependiendo de laspartículas que se van a separar, por ejemplo en gel de agarosa es un método que ya esta establecido para identificar, separar y purificar fragmentos de ADN, aunque no se puede separar adecuadamente con otros procedimientos este puede localizarse en el gel tiñendo con
una baja concentración de bromuro de etidioii, que se usa como colorante.
Otro gel que es muy utilizado para la separación deproteínas es el gel de poliacrilamida ya que tiene varios beneficios como transparencia, porosidad controlable, compatibilidad con muchos compuestos. Esta formada por cadenas de porosidad uniforme que se pueden regular variando las condiciones de reacción y las concentraciones de los monómeros. Esta técnica permite hacer un estimado del peso molecular de una proteína comparando su movilidad electrónica conla de las proteínas con un PM ya conocido teniendo un margen de error del 10%.
El tamaño o peso se puede estimar comparándolos con el patrón de los marcadores comerciales de peso conocido.iii
Una de las aplicaciones hoy en día son para comparar muestras de un individuo enfermo frente a la de uno sano, para ara la identificación de ácidos nucleicos de agentes infecciosos o para la obtención de unfragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel, puede ser extraído para análisis posteriores.

Objetivos

Familiarizarse con métodos de separación de proteínas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida.
• Aislamiento y purificación de caseína a partir de leche mediante la utilización de un “Kit” comercial.
• Determinación de los tamaños moleculares de las proteínasmediante electroforesis en gel de poliacrilamida.

Materiales y métodos

Preparación de geles para SDS-PAGE (Laemli, 1970)
Las cantidades que se describen a continuación sirven para el sistema de minigeles de Bio-Rad (Mini-Protean II). Las mismas pueden adaptarse para otras cámaras de diversa capacidad, conservando las proporciones.
1. Para la preparación del gel separador o inferior (5ml grosor=0.75mm), mezclar los siguientes reactivos según el porcentaje de gel deseado, en un frasco Kitasato de 50ml.

2. Preparar el molde para hacer el gel. Hacer una marca a 1 o 1.5cm debajo del nivel del peine de muestras. Retirar el peine.
3. Con la mezcla de reactivos a temperatura ambiente desgasificar aplicando vacío por 15 min.
4. Iniciar la polimerización agregando 3μL de TEMED y 15μL de persulfato deamonio a la mezcla. Inmediatamente mezclar y verter la solución en los vidrios (molde), hasta la marca hecha en el paso 2 sin atrapar burbujas. Acto seguido eliminar el menisco en la superficie con una delgada capa (1-2mm de grosor) de agua destilada o isobutanol, depositada muy suavemente sobre la mezcla. Dejar que polimerice el gel (10-20min).
5. Una vez que la interface entre el polímero y...