Lisozima

1.Introducción y objetivos:

La lisozima es el nombre recibido por un grupo de proteínas que hidrolizan enlaces glicosídicos beta (1-4) de ciertos polisacáridos. Existe en numerosos organismos: bacterias, virus, plantas y animales vertebrados e invertebrados. En humanos puede encontrarse en la saliva, mucus o lágrimas entre otros fluidos.
Es una enzima relativamente estable y pequeña, quepuede ser fácilmente aislada en grandes cantidades, por ello fue la primera proteína de la cual se determinó su estructura tridimensional por difracción de rayos X (Alberts et al.,2002)
La lisozima de clara de huevo tiene una masa molecular de unos 13900 Da, alrededor de 129 residuos, un PI de 11 y está formada por una única cadena polipeptídica (Nelson DC et al., 2000).
La lisozima es capaz deescindir los polisacáridos de las paredes bacterianas (N-acetilmurámico y N-acetilglucosamina).
Debido a la mencionada actividad de la lisozima, esta ayuda a mantener esteril el huevo de gallina y en el caso del ser humano permite por ejemplo mantener esteril la superficie del ojo (Lodish et al., 2005).
Los métodos mas comunes de aislamiento y purificación de la lisozima son la cromatografía deintercambio catiónico usando amerlita como fase estacionaria y la cromatografía de penetrabilidad usando sephadex como fase estacionaria.
El objetivo principal de este estudio era la purificación de la lisozima de clara de huevo de gallina, para ello se sometió en primer lugar a la clara de huevo a un tratamiento ácido y a un tratamiento térmico, esta es una forma de desnaturalizar algunas proteínaspresentes en la clara de huevo sin afectar a la lisozima, ya que esta es estable a ph ácido y a las temperaturas usadas.
Seguidamente se sometió la muestra a cromatografía. Se realizaron dos cromatografías:
Intercambio iónico con amberlita CG50, esta posee cargas positivas a ph neutro y básico y por tanto retiene a la lisozima que presenta cargas negativas al ph del tampón usado (6,6).Alternativamente se realizó una cromatografía de penetrabilidad en la cual se llevaron a cabo estudios de actividad y cantidad de enzima en cada etapa del proceso
Además se realizaron estudios de actividad y concentración de enzima para cada etapa de purificación, así como una electroforesis para determinar la composición de proteínas en cada una de dichas etapas y la masa molecular de la lisozima.2.Materiales y métodos:

En primer lugar se procedió a realizar la purificación de la lisozima.
Se comenzó con la preparación de extracto E1, para ello se hizo uso de un huevo de gallina de granja color marrón y tamaño L separando la yema de la clara y diluyendo esta a ¼ por medio de ácido acético 1M.
Se homogeneizó durante 5 min por medio de un agitador magnético y tras ello se filtró con gasadoble.
Esta clara diluida y filtrada fue centrifugada en una centrífuga de mesa durante 5 minutos a 4.500 rpm con el objetivo de separar la proteínas desnaturalizadas por el tratamiento ácido. Del sobrenadante (E1) se midió su volumen y se separó 1 ml para PAE. El resto de E1 se introdujo en un baño (Bunsen) a 60 ºC durante 5 min tras lo cual se cambió a hielo (4ºC, 5min), el propósito era ladesnaturalización por temperatura de proteínas disintas a lisozima.
Pasado este tiempo se centrífugo a 4500 rpm durante 5 min con el mismo fin que la anterior centrífuga. Del sobrenadante E2 se midió su volumen y se separó 1 ml para PAE. El resto de E2 fue cromatografiado. Las cromatografías que fueron usadas fueron las de penetrabilidad e intercambio iónico, sin embargo en este informe trataremosla de intercambio iónico y en el apartado de resultados se expondrán los datos obtenidos por penetrabilidad.
Para la cromatografía de intercambio iónico se usó amberlita. La columna se cargó con 10 ml de E2 mas 2 ml de tampón fosfato 1M ph 7.0 y se lavó con tampón fosfato 0,1M ph 6.6 de esta forma eluyeron ciertas proteínas distintas a la lisozima, recogiéndose alícuotas de 10 ml, una vez que...