Aislamiento y purificacion de lisozima

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Aislamiento y purificación de Lisozima

Diego Martínez López

Introducción

Lisozima, (EC 3.2.1.17), enzima muy ampliamente distribuida entre los seres vivos, desde virus a eucariotas, incluye a un grupo de enzimas que catalizan la hidróisis de enlaces glicosidicos β(1→ 4) de los polisacáridos de la pared celular bacteriana, cuyo disacárido constitutivo es N-acetil glucosamina (NAG)-N-acetil murámico (NAM).

[pic]

Son proteínas globulares constituidas por una sola cadena polipeptídica (129 aminoácidos para la lisozima de Gallus gallus), con cuatro enlaces disulfuro y de peso molecular comprendido en el rango de 14 a 30 KDa. Descubierta por Fleming [1]en 1922, fue primera proteína secuenciada, la primera enzima de la que sedispuso de un modelo tridimensional (usando cristalografía de rayos x) y la primera para la que se propuso un mecanismo de acción detallado.

Materiales y métodos

Biológico

Huevo de gallina.

Purificación de lisozima

Se toman 16 ml de clara de huevo diluida y filtrada 1/4 con ácido acético 0.1M y luego de eliminar los restos insolubles por centrifugación a 4500 rpm por 5 minutos, 15ml delsobrenadante [E1] se aplican en un baño de hielo durante 5 minutos y se centrifugan a 4500 rpm durante 5 minutos, tras eliminar los restos insolubles por centrifugación, 13 ml [del sobrenadante [E2] se aplicaron a una columna de Amberlita CG-50 (((3cm), equilibrada con buffer tampón fosfato potásico 0.1M, pH 6.6, eluir la muestra con tampón fosfato potásico 0.6M, pH 6.6. También 1ml delsobrenadante [E2] se aplico a una columna de Sephadex G-75 (1,4 x 45cm), equilibrada con buffer ácido acético 0.1M, eluir la muestra con ácido acético 0.1 M. Las fracciones con mayor actividad fueron reunidas [E3].

Ensayo enzimático

La medida de la actividad de lisozima se realiza utilizando el método de Morsky P[2], hidroliza la suspensión bacteriana de Micrococus lisodeikticus que se aclara (pierdeturbidez) permitiendo medir la actividad enzimática siguiendo el declive de la absorbancia a 450 nm, en condiciones estándar (25ºC, pH 6,2 y 0,1 M fosfato), se considera que 1 unidad de actividad enzimática de lisozima (UAL) produce una disminución en la absorbancia de 0,001 por minuto.

Determinación de la concentración de proteínas

El cálculo de la concentración de proteína, se determinópor la absorción a 595nm, mediante el método de Bradford[3], utilizando BSA como proteína patrón, e interpolando los valores de absorbancia a 595nm de E1, E2 y E3 en dicha recta para averiguar su concentración.

Electroforesis

La pureza y el peso molecular de la enzima fueron determinados por electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS), utilizandocomo colorante azul de coornassie 0,5% [4](Weber & Osbom, 1969).

Esquema de purificación

Cc

Resultados

El perfil de elución obtenido de la purificación de lisozima mediante shepadex G-75 se muestra en la figura 1, en ella se observa una proteína con dos picos bien definidos y un codo donde se aprecia la mayor parte de la actividad enzimática.

En la cromatografía se obtuvo uncomponente con actividad enzimática, el cual fue recogido en fracciones, desde los 48ml hasta los 56ml los cuales formaban parte de un codo con baja concentración de proteína , presentando una actividad media de 500 UAL/ml. Al final de esta etapa la enzima fue purificada 2.5 veces y con un rendimien de 13.2% (Tabla 1). [pic]

Figura 1. Cromatografía de shepadex, el contenido de proteína fue medido porabsorbancia a 280nm. La actividad de la lisozima se determino por Micrococus lisodeikticus absorbancia a 450nm. Volumen de elución de la columna cromatogáfica 24ml y volumen total 66ml.

El cálculo de la actividad enzimatica de E3 se obtuvo de la mezcla de las diferentes fracciones que presentaban mayor actividad (25, 26, 27, y 28), obteniéndose un valor medio de 356 UAL/ml.
[pic]El E3 de este...
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