Métodos De Secuenciación

Principales Características de los Métodos Modernos de Secuenciación

José M. Henríquez1, Carola Mantellero1

1 Universidad de Concepción, Departamento de Biología Molecular, Carrera de Bioquímica, Concepción, Chile.



Resumen— Gran impacto en la genética ha causado la aplicación de técnicas de secuenciación, principalmente las de secuenciación de ADN de nueva generación(next-generation DNA secuencing, NGS), la NGS se basa en la utilización de plataformas, de las cuales las más importantes son Roche/454 FLX, Illumina / Solexa Genoma Analyzer, y el Applied System SOLiD™ Biosystems. También se pueden nombrar la “Secuenciación de alto rendimiento de regiones cromosomales microdisecadas” y la “secuenciación directa de ARN” como nuevas técnicas de secuenciación. En cuanto a laaplicación que puede ofrecer la NGS, se puede citar la secuenciación de ADNs fósiles, el descubrimiento del ARN no codificante (ARNnc), la metagenómica y la detección de mutaciones, entre otras.
Palabras claves— Secuenciación, secuenciación de ADN de nueva generación, Illumina, Roche/454, SOLiD.







I. INTRODUCCIóN

La secuenciación del ADN comienza en 1973, dondeGilbert y Maxam publicaron una secuencia de 24 pares de bases utilizando un método conocido como "de punto corrido" (wandering spot). Luego durante treinta años la mayor parte de la secuenciación de ADN se llevó a cabo con el método de terminación de la cadena desarrollado por Frederick Sanger y colaboradores en 1975. El método de Sanger se basa en el empleo de didesoxinucleótidos que carecen de uno delos grupos hidroxilo, de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, esta cadena no puede continuar. Se trabaja con cuatro tubos, un tubo con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con  ddGTP y el cuarto con ddCTP. Luego en un gel se analizan los distintos tamaños de secuencias de ADN formadas.
Desde la finalización del Proyecto Genoma Humano(PGH), se han producido cambios sustanciales en el enfoque de la secuenciación del genoma, los cuales se han alejado de la utilización de secuenciación por electroforesis capilar y de cromosoma artificial bacteriano BAC (vector para clonar fragmentos de ADN) y se han enfocado hacia la secuenciación del genoma completo (whole genome sequencing, WGS). En el enfoque de WGS, el ADN genómico es escindidodirectamente en varios tamaños y son colocados en subclones plasmidiales. El aumento del tamaño de los extremos de estos subclones para generar pares de lecturas de secuenciación final proporciona la información necesaria para la vinculación de todo el genoma. Sin embargo, ese escenario está cambiando rápidamente debido a la invención y la introducción comercial de varios enfoques revolucionariospara la secuenciación de ADN, como el de la secuenciación de nueva generación (NGS).


Estos secuenciadores se basan en un principio diferente del método de Sanger, y pueden secuenciar de uno a varios millones de plantillas de una vez [1]. Éstos no sólo están cambiando nuestros métodos de secuenciación del genoma, además los tiempos y costos asociados, sino que también la aceleración y lamodificación de una amplia variedad de investigaciones biológicas basadas en la detección de secuencias génicas. El resultado neto de lo expuesto es que los genomas se pueden secuenciar a una mayor velocidad y más fácilmente.
Sin embargo, secuenciar el genoma humano por primera vez fue un proceso lento y muy costoso, pero ahora, con el desarrollo de las Next Generation Sequencing (NGS,secuenciación de ADN de nueva generación), este proceso sería más rápido y menos costoso (100 veces menor).


Además, estas plataformas de última generación están ayudando a abrir nuevas áreas de investigación biológica, incluyendo la investigación de genomas antiguos.

II. Secuenciación de ADN de nueva generación (ngs)

Tres plataformas [2] de secuenciación masiva de ADN en...