Materiales y metodos guia 5

Materiales y métodos

ACTIVIDAD Nº 1: Fraccionamiento subcelular:
A) Fraccionamiento Subcelular de Hígado:
La profesora preparo un homogenizado, para ello tomo con pinzas un trozo de hígado de polloy lo puso en un vaso precipitado.
Utilizando un homogeneizador obteniendo así, un líquido que traspaso a otro vaso precipitado. Luego uso un embudo y gasa para separar el líquido de lo que quedosólido, el líquido que quedo fue nuestro homogenizado.
El cual transferimos en un tubo para centrifuga, inmediatamente se puso en hielo para mantenerlo a una temperatura de 4ºC, luego se puso en lacentrifuga a 2500 rpm por 10 minutos; pasados los diez minutos se obtuvo un sobrenadante que fue puesto en un segundo tubo Falcón y se volvió a centrifugar, pero esta vez a 6000 rpm por 20 minutos, alpellet que quedo en el tubo nº 1, se le agregaron 5ml de suero, se mezcló con una pipeta y se puso en hielo para que pudiera ser usado más tarde,.
Pasado los veinte minutos se botó el sobrenadante, alpellet nº 2 se le agrego 5ml de suero, se mezcló y se puso en la centrifuga a 6000 rpm por 20 minutos, el sobrenadante obtenido se transfirió a un nuevo tubo Falcón y el pellet se mezcló nuevamente con5ml de suero obteniendo al final tres tubos Falcón; uno con solución de núcleos, otro con material mitocondrial y por ultimo uno con material microsomal, todos los tubos se mantuvieron en hielo.
B)Evaluación del fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares:
En dos portaobjeto, colocamos con pipeta una gota de la solución de núcleos, a la primera le colocamos inmediatamente elcubreobjetos, al segundo, primero le agregamos una gota de azul de tripan y luego el cubreobjetos, ambos fueron observados en el microscopio a 40X.
Preparamos cuatro tubos de ensayo con 1 ml de succinato, 1ml de agua destilada y 1 un ml de azul de metileno, luego agregamos a uno de los tubos 1 ml de fracción nuclear, al segundo 1 ml de fracción mitocondrial, al tercero 1 ml de fracción microsomal y...