Microensayo Azul Alamar

Método para la realización del microensayo

Preparación de la suspensión bacteriana de trabajo
a) A partir de medio liquido
* Tomar una alícuota de 1ml de crecimiento bacteriano joven 2 a 5semanas crecido en medio 7H9 con glicerol, Tween 80 y 10% de enriquecimiento comercial y transferirlo a un tubo con topa de rosca.
* Ajustar la suspensión al tubo 1 de McFarland con medio decultivo 7H9 (con glicerol y 10% de OADC, sin Tween).
* De la suspensión anterior realizar una dilución 1:20 con medio 7H9(con glicerol y 10% de OADC, sin Tween).
b) A partir de agar
* En untubo agregar perlas de vidrio y depositar 2ml de medio 7H9(con glicerol y 10% de OADC, sin Tween).
* Tomar tres a cuatro asadas abundante crecimiento bacteriano joven y depositarlo en el tubo.
*Suavemente agitar el tubo para disgregar los grumos de bacterias.
* Dejar que sedimente los grumos grandes y recoger el sobrenadante homogéneo.
* Tomar una alícuota de 1ml y ajustar a 1 deMcFarland con medio 7H9 (con glicerol y 10% de OADC, sin Tween).
* De la suspensión anterior realiza runa dilución 1:20 con medio 7H9 (con glicerol y 10% de OADC, sin Tween).
C) preparación de lasdrogas
La dilución de las drogas será la adecuada para tener 4 veces la concentración máxima a probar en el ensayo, ejemplo la concentración máxima a utilizar de rifampicina es de 2 microgramos pormililitro, por lo que se deberá preparar la solución a una concentración de 8 g/mL, si el stock tiene una concentración de 1mg/ml, se deben adicionar 8l del stock a un mililitro de medio.
c)Preparación de la microplaca
* Tomar una placa para cultivo de 96 pozos
* Llenar los pozos de la periferia con 200 l de agua destilada estéril: A del 1-12; H del 1-12; 1 del B-G; 12 del B-G.* A los 60 pozos restantes adicionales 100l de medio 7H9 (con glicerol y 10% de OADC, sin Tween).
* Al pozo B de las hileras 2 a la 10 adicionar 100 l de la solución de trabajo de cada...