mutagenesis

Un paso de inactivación de los genes de los cromosomas en Escherichia coli K - 12 utilizando los productos de PCR

Hemos desarrollado un método simple y altamente eficiente para interrumpir genes de los cromosomas en Escherichia coli en la que los cebadores de PCR proporcionan la homología con el gen objetivo ( s ) . En este procedimiento , la recombinación requiere la recombinasa Red del fagolambda , que se sintetiza bajo el control de un promotor inducible en un fácilmente curables , bajo número de copias del plásmido . Para demostrar la utilidad de este enfoque , se generaron productos de PCR mediante el uso de cebadores con 36 - a las extensiones 50 - nt que son homólogas a las regiones adyacentes al gen a ser plásmidos inactivadas y de la plantilla que llevan genes de resistenciaa antibióticos que están flanqueados por FRT ( reconocimiento de FLP objetivo) sitios. Mediante el uso de los respectivos productos de PCR , hicimos 13 diferentes alteraciones de genes cromosómicos. Los mutantes de la ARCB , cyaA , lacZYA , ompR - envZ , phnR , PSTB , pstCA , pstS , pstSCAB - PHOU , recA , y los genes torSTRCAD o operones fueron aisladas como colonias resistentes a losantibióticos después de la introducción en bacterias que llevaban un plásmido de expresión Rojo ( generado por PCR ) de ADN sintético . Los genes de resistencia fueron luego eliminados mediante el uso de un plásmido auxiliar que codifica la recombinasa FLP que también es fácilmente curables . Este procedimiento debería ser ampliamente útil, especialmente en el análisis del genoma de E. coli y otras bacteriasdebido a que el procedimiento se puede realizar en las células de tipo salvaje .

La disponibilidad de la secuencia completa del genoma bacteriano ha proporcionado una gran cantidad de información sobre la estructura molecular y la organización de un gran número de genes y ORFs cuyas funciones son poco conocidos . Un análisis mutacional sistemática de los genes en su ubicación normal puedeproporcionar una información valiosa sobre su función . Aunque un número de métodos de reemplazo de alelo generales ( 1-7 ) se puede utilizar para inactivar genes cromosómicos bacterianos , todos estos requieren la creación de la interrupción del gen en un plásmido adecuado antes de combinarlo en el cromosoma . En contraste , los genes pueden ser interrumpidos directamente en Saccharomyces cerevisiaepor transformación con fragmentos de PCR que codifica un marcador seleccionable y que tiene sólo 35 nt de ADN flanqueante homóloga al cromosoma ( 8 ) . Este método de sustitución de genes mediada por PCR ha facilitado en gran medida la generación de mutantes específicos en el análisis funcional del genoma de la levadura , sino que se basa en la alta eficiencia de la recombinación mitótica en lalevadura ( 9 ) . Interrupción dirigida de genes cromosómicos también se puede hacer de Candida albicans mediante el uso de fragmentos de PCR similares con 50 - a las extensiones de homología de 60 - nt ( 10 ) .

En contraste con la levadura y unas pocas bacterias naturalmente competentes , la mayoría de las bacterias no son fácilmente transformable con ADN lineal . Una de las razones deEscherichia coli no es así es transformable debido a la presencia de exonucleasas intracelulares que degradan el ADN lineal ( 11 ) . Sin embargo , los mutantes que carecen de recombinación con dominio exonucleasa V de la compleja recombinación RecBCD son transformable con ADN lineal ( 12 ) . La recombinación puede ocurrir en RecB o recC mutantes que llevan un supresor de mutación ( SBCA o SBCB ) que activauna vía de recombinación alternativa ; SBCA activa la recombinasa Recet del profago Rac , mientras que SBCB mejora la recombinación por la vía RecF ( 13 ) . Tales mutantes SBCB recBC han sido especialmente útiles para recombinación in vitro mutaciones construidas en el cromosoma de E. coli mediante el uso de ADN lineal ( 14 ) . El descubrimiento de que los mutantes son RecD recombinasa dominio...