Mutagenesis

DISEÑO MOLECULAR DE SUBTILISINAS CON NUEVAS PROPIEDADES
BIOQUÍMICAS MEDIANTE ENFOQUES DE MUTAGÉNESIS RACIONAL Y
EVOLUCIÓN DIRIGIDA
Eliel R. Romero-García, Joel A. Esquivel-Naranjo, Jesús García-Soto, Mario Pedraza-Reyes1
Instituto de Investigación en Biología Experimental de la Facultad de Química, Universidad de Guanajuato,
Apdo. Postal 187, Guanajuato, Gto. CP. 36000, México. Fax (473) 2-00-06ext. 8153
Correo electrónico: 1 mariopr@utdallas.edu
Palabras Clave: subtilisina, evolución dirigida
Introducción. El estudio de las proteasas ha permitido un
avance substancial en el entendimientode las bases
moleculares que rigen la relación estructura-función de las
enzimas (1,2). Bacillus subtilis es un microorganismo
ampliamente utilizado en diferentes aspectos biotecnológicos por sucapacidad para producir una gran diversidad
de compuestos con actividades diversas como proteasas,
insecticidas, antibióticos, entre otros. La subtilisina E es una
proteasa de serina codificada por el genaprE de B. subtilis
168 (3). En nuestro laboratorio, para mejorar su eficiencia
catalítica (Kcat), obtuvimos por mutagénesis aleatoria in vivo
del gen aprE una enzima mutante con una Km dos vecessuperior a la de la enzima silvestre. La secuenciación del gen
aprE variante reveló una doble mutación que resultó en una
sola sustitución, v.g. Ser85A, localizada en el extremo –
COOH del asa que conectauna hoja ? con un hélice?? , la
cual contiene el residuo catalítico His 64 (4. Se han reportado
otras mutaciones puntuales en esta región, las cuales generan
enzimas con propiedades bioquímicas deinterés para su
aplicación a nivel industrial. El propósito de este estudio es
establecer la función del residuo 85, de la tríada 83GVS85 y
la región conformada por los aminoácidos T71-A 82 del gen
aprEsilvestre. La purificación y caracterización bioquímica
de la (s) enzima (s) mutantes contribuirá en abundar en el
conocimiento de la relación estructura-función de la
subtilisina E.

utilizando...