Métodos enzimáticos

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICA ANALÍTICA AVANZADA

MÉTODOS ENZIMÁTICOS DE ANÁLISIS

Octubre 2008

Índice
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1.- Introducción. 2.- Cinética de las reacciones enzimáticas. 3.- Análisis enzimático. 4.- Aplicaciones. 5.- Conclusiones 6.- Bibliografía

1.- Introducción
Enzimas:
Biocatalizadores de naturaleza proteica, elevado PM yconformación tridimensional característica. Catálisis en el centro activo Su particular conformación estructural y funcional le confiere una elevada especificidad. Poseen una gran eficiencia catalítica: Factor de incremento de la velocidad de reacción: 108-109.

Adecuadas para la determinación de especies en bajas concentraciones y en matrices complejas Limitaciones: •Condiciones controladas dereacción (“fisiológicas”): pH, T, etc. •Existencia de algún intermediario detectable.

1.- Introducción
Teorías sobre la unión enzima-sustrato: Teoría de Fischer (llave-cerradura). Teoría de Koshland (ajuste inducido).

Métodos enzimáticos de análisis: Aplicables para la determinación de sustratos de las reacciones enzimáticas, enzimas y activadores e inhibidores de las mismas. Métodos cinéticoso de equilibrio. Gran aplicación en análisis clínicos, industria alimentaria, etc.

2.- Cinética de las reacciones enzimáticas
Mecanismo propuesto por Michaelis-Menten:

Modelo de Michaelis-Menten: Supuestos: [S]>>[E] k2KM Análisis de sustratos: [S]KM

[A] o [I] limitantes en cada caso

k2 [ E0 ][ S ] V= ( K M + [ S ])

2.- Cinética de las reacciones enzimáticas
ActivadoresSustancias que aumentan la actividad enzimática (Cofactores, coenzimas, grupos prostéticos).

Inhibidores

Disminuyen la actividad de los enzimas •Irreversibles (Unión covalente al enzima) •Reversibles (Unión no covalente) Competitivos No competitivos Acompetitivos

2.- Cinética de las reacciones enzimáticas
Inhibidores competitivos: El inhibidor compite con el sustrato por el centro activo:-No varía la Vmáx -Aumenta KM

2.- Cinética de las reacciones enzimáticas
Inhibidores no competitivos: Se une al enzima en un sitio distinto del centro activo. No compite con el Sustrato. • No varía KM • Disminuye Vmax

2.- Cinética de las reacciones enzimáticas
Inhibidores acompetitivos: Unión del inhibidor al complejo ES, estabilizándolo (disminución de KM) pero impidiendo que se forme elproducto (disminución de Vmax).

3.-Análisis enzimático
MÉTODOS ENZIMÁTICOS

Se basan en:

Toda sustancia que participe en una reacción enzimática puede determinarse cuantitativamente debido a la alta especificidad de las enzimas

1

De cambio total, equilibrio o punto final

2
Métodos Cinéticos

3.-Análisis enzimático
MÉTODOS ENZIMÁTICOS

Se basan en:

Toda sustancia queparticipe en una reacción enzimática puede determinarse cuantitativamente debido a la alta especificidad de las enzimas Dejan que la reacción transcurra hasta el estado de equilibrio

1

De cambio total, equilibrio o punto final

2
Métodos Cinéticos

3.-Análisis enzimático
MÉTODOS ENZIMÁTICOS

Se basan en:

Toda sustancia que participe en una reacción enzimática puede determinarsecuantitativamente debido a la alta especificidad de las enzimas

1

De cambio total, equilibrio o punto final

2
Métodos Cinéticos

Miden la velocidad inicial de la reacción

3.-Análisis enzimático
1
De cambio total, equilibrio o punto final

Se deja que la reacción alcance su equilibrio y se cuantifica el cambio total ocurrido por medio de análisis físicos, químicos o enzimáticos“ En algunos casos, uno de los sustratos o productos posee propiedad física o química diferencial que permite seguir la reacción durante su desarrollo y realizar simultáneamente el análisis”


El cambio total ocurrido puede estimarse por análisis de una sustancia (S, P o Cofactor) que participe en la misma o en otra reacción acoplada lo que permite subdividir estos métodos en:

De un...