Obtencion y Cuantificacion De Proteinas

Aislamiento, purificación y cuantificación de caseína.
Departamento de Química
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Nariño, San Juan de Pasto, Colombia.

Carolina Cerón (26140281), Vanessa Jurado Dávila (27140284).
Fecha xxxx
Resumen: Se aisló u purificó caseína de leche de vaca por medio de variaciones de pH, adicionando CH3COOH 25% hasta su precipitación, se encontróque su punto isoeléctrico estaba a un pH aproximado de 4.8. Se centrifugó a 2000 rpm por 5 min y se purificó la proteína con EtOH 95%, se adicionó EtOH-éter 1:1 donde se obtuvo un peso de 2.17g de caseína con un rendimiento superior al 100% debido a posibles residuos de otros componentes de la leche. Se cuantificó la caseína por medio de métodos: Biuret, absorción UV, Bradford y de Lowry con elespectrofotómetro donde se evidenció buenos resultados en las muestras patrón, pero no en las del extracto de caseína por posibles impurezas en las soluciones.
Palabras Clave: Caseína, punto isoeléctrico, espectrofotómetro.
Introducción:

La práctica se realizó con el fin de obtener y caracterizar proteínas en muestras biológicas, en este caso se realizó la extracción de caseína que es laprincipal proteína de la leche de vaca la cual es una mezcla de varias sustancias como lactosa, lípidos, proteínas, aminoácidos, creatinina de urea, etc. [1]

La leche contiene diversas proteínas, de las cuales las caseínas son las más abundantes, ya que representan el 80% de las proteínas totales; las más importantes son la α, la β y la κ, que representan, el 50, 30 y 15% del total de lascaseínas. En la leche, estas proteínas se asocian entre si para formar micelas, que se encuentran estabilizadas y solubilizadas gracias a la presencia de la caseína κ, y del calcio. [2]
La extracción de proteínas en análisis bioquímico requiere generalmente de un gran trabajo ya que la célula contiene miles de sustancias diferentes, además la molécula que se busca puede ser muy inestable ocontaminarse a concentraciones muy bajas. Los métodos para la caracterización depende de la naturaleza de la proteína, unos de ellos son el de Biuret que sirve para analizar proteínas ya que los compuestos que contienen dos o más enlaces peptídicos que dan un color rosado o lila característico, cuando se tratan con CuSO4 diluido en solución alcalina. El método de absorción en el U.V se da por medidas deabsorvancias a 280 nm, son utilizadas con frecuencia para determinar la concentración de moléculas en solución. La absorbancia está relacionada linealmente con la concentración de acuerdo con la ley de Lambert-Beer:

A = ε x c x l
Donde: A: absorbancia

c : concentración molar

l : espesor de la celda en cm

ε: coeficiente de absorción molar
El Método de Bradford sebasa en la reacción de la forma amónica de residuos de arginina o de lisina, histidina, triptófano, tirosina y fenilalanina de la proteína, con la forma catiónica del reactivo azul de coomassie G-250, formando un complejo de color azul cuya absorción máxima se presenta a 595 nm. Y el Método de Lowry donde Para aumentar la sensibilidad de la reacción del Biuret, el complejo proteína Cu+2 se hacereaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteau dando una coloración azul, con un máximo de absorción a 580nm. En todos estos métodos es factible medir la absorvancias con el espectrofotómetro. [3]

Materiales y métodos:

Aislamiento y purificación de Caseína de leche de vaca:

A 30mL de leche de vaca, se le adicionó CH3COOH 25% gota a gota en agitación hasta que se evidenció un precipitado,se midió el pH con papel universal. Se centrifugó a 2000 rpm por cinco minutos, se realizaron lavados con agua destilada donde el sobrenadante fue desechado y se volvió a centrifugar. Se resuspendió el residuo en 20mL de EtOH 95% y se centrifugó, se eliminó el sobrenadante. Se adicionó 20mL de EtOH-éter 1:1 al residuo y se centrifugó de nuevo, se eliminó el sobrenadante y el precipitado se lo...