Organizacion subcelular

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UNIVERSIDAD ANDRÈS BELLO
FACULTAD CIENCIAS BIOLOGICAS
DEPARTAMENTO CIENCIAS BIOLOGICAS
LABORATORIO BIOLOGIA CELULAR
PROFESORES: Alejandra Verdejo
Victoria Devia

Trabajo Práctico Nº:
Organización Subcelular

Autores: Felipe BeuzenbergGuzmán
Diego Cortés Ibacache
Sebastián Vega Ahumada

- 2010 –
Introducción

La célula siendo una unidad estructural y funcional, microscópica de todos los organismos vivos contiene una compleja organización en sus componentes denominada organización subcelular. Para poderestudiar esta organización existen distintos métodos, pero en este caso será utilizado el fraccionamiento celular.
“El fraccionamiento subcelular es un conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas en un determinado componente celular, ya sea éste un orgánulo (mitocondrias, núcleos, peroxisomas,…) una fracción de membrana (membrana total,plasmática, dominio basolateral, dominio apical,...), complejos multiproteicos (citoesqueleto de actina, microtúbulos, poros nucleares, etc...)”. Esta técnica se divide en dos fases, primero, la Homogenización que se logra por medio de técnicas como la sonicación (por ondas sonoras a altas frecuencias), shock omótico (aumento repentino de la presión osmótica) o moliendo la muestra, obteniendo elhomogenizado. Luego se lleva a la segunda fase, la Centrifugación, la que “separa los componentes celulares sobre la base de su tamaño y su densidad. Los componentes de mayor tamaño y densidad mas elevada experimentan la mayor fuerza centrifuga y se mueven con mayor rapidez. Sedimentan para formar un precipitado en la base del tubo, mientra que los componentes más pequeños y menos densos se mantienen ensuspensión, en la parte denominada sobrenadante”. Para diferenciar los organelos encontrados en los distintos sobrenadantes, se utilizan los marcadores moleculares biológicos, que son moléculas indicadoras de cierto organelo. Como lo son el DNA en el núcleo o la enzima succinato deshidrogenasa para la identificación de la mitocondria, entre otras.

Objetivos

1- Entender y aplicar el método defraccionamiento celular.
2- Identificar organelos celulares.

Materiales y métodos

Primero se recibio un homogenizado filtrado de higado realizado por las docentes, este se obtuvo de la siguiente manera:

1) Se dejo en inanición un raton la noche antes del experimento.
2) Matar al ratón adulto ( cerca de 30 g) por dislocación cervical y rápidamente extraer el hígado de la cavidadperitoneal ( descartando la vesícula biliar). Dejar el hígado en 50 ml de Buffer IBc frío en un vaso pequeño.
3) Dejar el hígado libre de sangre usando IBc frío ( usualmente entre 4 y 5 clarificaciones es suficiente)
4) Picar el hígado en pequeños trozos utilizando tijeras. Esto podría ser realizado mientras se mantenga el vaso en una fuente con hielo.
5) Descartar el IBc usandodurante picado y reemplazarlo con 5 ml de IBc frio fresco y transferir la suspensión al tubo de homogenizado (mortero) y operarlo a 1600 RPM mezclándolo de 3 a 4 veces.
6) Transferir el homogenizado a un tubo Falcon de polipropileno y centrifugar a 1700 RPM por 5 min. a 4ºC.

Una vez recibido esto, se comenzo a desarrollar el practico.

Se separo la fraccion nuclear obtenida del sobrenadante,y este ultimo fue llevado en un tubo falcon a centrifugacion por 30 min. A 6000 RPM.
El pellet 1 se suspendo en 3 ml de buffer IBc frio. Luego se observo una gota en el microscopio.
Se tomo otra gota, a la que se le agrego la tincion de azul de tripan, para asi poder observar claramente los núcleos en el microscopio. La observación se registro en dibujos.
Durante todo el proceso, el pellet...