Pcr tiempo real

PCR en tiempo real, una nueva herramienta para la toma de decisiones clínicas
A. JIMÉNEZ VELASCO1, J. ROMÁN GÓMEZ 2, X. AGIRRE 3, M. BARRIOS1, G. NAVARRO1, E. SAN JOSÉ ENÉRIZ 3, L. CORDEU 3, L. GÁRATE 3, J.A. CASTILLEJO 2, F. PROSPER 3, A. TORRES 2 Y A.I. HEINIGER1
1 Servicio de Hematología. Hospital Universitario Carlos Haya. Málaga. 2Servicio de Hematología. Hospital Universitario ReinaSofía. Córdoba. 3Servicio de Hematología. Clínica Universitaria de Navarra. Pamplona.

Introducción
Desde el descubrimiento por Mullis et al 1 de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en 1983 hasta nuestros días, probablemente ninguna técnica de laboratorio haya evolucionado tanto en tan poco tiempo, ni haya aportado tanta información al conocimiento científico. Sus aplicaciones han ido desdela secuenciación del genoma, la identificación de nuevos genes y polimorfismos, hasta el análisis cuantitativo de expresión y el conocimiento de anomalías cromosómicas estructurales y epigenéticas 2-4. Su aplicación en hematología ha estado principalmente centrada en el estudio de translocaciones o reordenamientos cromosómicos y en el análisis de mutaciones. En sus inicios el estudio de un gen defusión mediante PCR era meramente cualitativo, tan sólo podíamos hablar de la presencia o ausencia del mismo. A finales de 1980 y principios de 1990 surgen las primeras tentativas para cuantificar la expresión o cantidad de ARN-ADN presente en una muestra mediante los estudios de PCR competitiva 5-7. Pero es realmente con el desarrollo de la técnica de PCR en tiempo real (PCRtr) a finales de 1990y principios del nuevo siglo, cuando la cuantificación de la expresión alcanza su verdadera importancia en la práctica clínica, intentando establecer nuevos factores que influyan en la génesis y pronóstico de la patología hematológica y principalmente en el seguimiento mediante los estudios de enfermedad mínima residual (EMR) 8,9. Sin embargo, las aplicaciones de la PCRtr no se limitan sólo a lacuantificación de la expresión de genes, también es posible el estudio de mutaciones o polimorfismos de un solo nucleótido mediante el análisis de temperaturas de fusión, el estudio de deleciones o pérdidas de heterozigocidad, el estudio del estado de metilación de los genes, etc.10-12.

Aspectos técnicos de la PCRtr: plataformas, química y métodos de cuantificación
El fundamento de la PCRconvencional y de la PCRtr es idéntico, la amplificación de un material genético (ADN o ARN) que se encuentra en poca cantidad mediante un termociclador y ciclos consecutivos de des00

naturalización del ADN, hibridación de cebadores con el gen diana y la extensión de la nueva molécula creada. La diferencia principal radica en que mientras en la PCR convencional el producto genético amplificado seobservaba o analiza al final de la reacción, en la PCRtr es posible ver la dinámica de las curvas de amplificación gracias a la presencia de fluorocromos unidos a sondas de hibridación que son detectados y analizados mediante un programa informático13. De esta forma podemos establecer con gran exactitud el ciclo de la PCR en el que la señal de fluorescencia de una determinada muestra sobrepasa elumbral mínimo o basal, este ciclo es denominado punto de cruce de la curva (Cp) (crosing point o threshold cycle). Este principio establece la base de la cuantificación mediante PCRtr, es decir, el ciclo en el que se empieza a detectar fluorescencia para un determinado gen es proporcional a la cantidad de dicho gen o reordenamiento en la muestra de ADN o ARN, a mayor cantidad de gen diana más precozserá el ciclo en el que la fluorescencia es detectada (fig. 1). Los métodos más utilizados son tres y varían dependiendo del tipo de sondas empleadas en la PCR. El primer método emplea un fluorocromo inespecífico (sybr green) capaz de unirse a cualquier molécula de ADN. Un segundo método usa las sondas de hidrólisis “TaqMan” (ABI Prism) para la detección del producto amplificado, es el método...