Pcr E. Coli

Amplificación del fragmento 16s ribosomal de Escherichia coli utilizando la técnica de PCR


RESUMEN
En el presente ensayo se tiene como objetivo amplificar un fragmento de ADN del rRNA 16S de E. coli mediante la aplicación de un protocolo de PCR, y su posterior corrida electroforética en gel de agarosa al 2%. La amplificación se realizó mediante un control positivo por error de pipeteoy un control negativo (sin el DNA plantilla), utilizando DNA de E. coli, Taq Polimerasa Termoestable, nucleótidos, primers, buffer, DDW , MgCl2 y glicerol. Para la electroforesis se utilizó una Buffer TBE 1X, Bromuro de Etidio, buffer (Blue Juice) y el marcador de peso molecular 100 bp (DNA Ladder Trackit Invitrogen). Se obtuvo un fragmento amplificado de 1300pb, pero de acuerdo a la intensidad delas bandas hubo un error en el pipeteo y al cargar el gel, por lo tanto una alteración en las concentraciones de los controles.
Palabras clave: PCR bifásica, 16s Ribosomal, amplificación.

ABSTRACT
In this essay aims to amplify a DNA fragment of 16S rRNA of E. coli through the application of a PCR protocol, and its subsequent run agarose gel electrophoresis on 2%. The amplification wasperformed using two positive controls for pipetting error and a negative control (without DNA template) using DNA from E. coli, thermostable Taq polymerase, nucleotides, primers, buffer, DDW, MgCl2 and glycerol. For electrophoresis we used a 1X TBE Buffer, Ethidium Bromide, buffer (Blue Juice) and molecular weight marker 100 bp (DNA Ladder trackIT Invitrogen). Amplified fragments were obtained 1300pb,but according to the intensity of the bands was a pipetting error and therefore a change in the concentrations of the controls.

Keywords : biphasic PCR, 16S Ribosomal, amplification.

INTRODUCCION:

PCR son las siglas en ingles de Polymerase Chain Reaction o Reacción en Cadena de la Polimerasa, cuyo objetivo es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasaque puede trabajar a temperaturas muy elevadas (Espinoza, 2000).

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar

hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para quevuelvan a duplicarlas (CULTEK, 2010).

Sin embargo esta técnica a tenido un gran desarrollo en la actualidad como la clonación directa de ADN genómico o cDNA, mutagénesis in vitro e ingeniería de DNA, tipificación genética de muestras forenses, análisis de la presencia de agentes infecciosos, diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas, análisis de variaciones de secuencias alélicas, análisisde transcritos y secuenciación directa a partir del DNA, entre otras muchas aplicaciones ya que son menos laboriosas, más rápidas y más flexibles; lo que permiten trabajar con un mayor número de muestras. (Gómez, 2009).

PCR bifásica es una alteración de la PCR estándar que permite la amplificación de una secuencia específica del genoma. La amplificación por PCR de menos de 1.000 bp se veobstaculizada por la síntesis de los dímeros y otros productos no esenciales, esto reduce el rendimiento, ya que consumen los nucleótidos y la enzima; para superar este problema, hemos ideado Booster PCR, una estrategia de amplificación bifásica (Ruano, Fenton, & Kidd, 1989).

Existen además otras técnicas de amplificación de ácidos nucleicos como son: Autisentida, LCR, QB replicasa.

TECNICAS DEAMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS

Replicación de Secuencia Autosostenida
También llamada Amplificación Basada en la Secuencia de Ácido Nucleico. Proceso isotérmico de amplificación de Nucleótidos in Vitro. El proceso implica la acción concomitante de una polimerasa de DNA , dirigida por RNA, una ribonucleasa y una polimerasa de RNA, dirigido por DNA para sintetizar grandes cuantidades de...