Práctica con la glutamina sintetasa

TÉCNICAS EXPERIMENTALES EN BIOQUÍMICA



Módulo 1


























Introducción

En el estudio a realizar en ésta práctica se utiliza la enzima glutamina sintetasa (GS) de la cianobacteria Synechocystis PCC 6803, ésta enzima junto con la glutamato sintasa, tiene un papel importante en la asimilación del amonio, en el ciclo GS-GOGAT
La actividadfisiológica del enzima a estudiar (GS) es la síntesis de glutamina a partir de glutamato y amonio, pero además cataliza otra reacción que no es fisiológica:

La actividad transferasa es varias veces superior a la biosintética, de modo que se utiliza para determinar la actividad. , y se puede cuantificar mediante espectrofotometría. Donde ésta actividad no fisiológica ayuda a localizar y cuantificarla enzima a través de la adición de una mezcla reveladora, donde el producto final de la reacción estudiada es γ-Glutamil hidroxamato que con la presencia de cloruro férrico en medio ácido da un compuesto coloreado y se puede medir a través de espectrofotometría.

La glutamina sintetasa de procariotas está formada por 12 subunidades de unos 50 kDa cada una. El gen que la codifica es el glnA yla secuencia de aminoácidos es conocida. Se sintetiza un plásmido que contiene el gen de la GS (gln A) y se clona en E. coli, de modo que en los cultivos de E.coli transformada se sobreexpresa la proteína, así que su purificación se facilita. Esas células se rompen por sonicación para liberar así todo su contenido, se separa luego la fracción soluble de la insoluble mediante una centrifugación,se recoge el sobrenadante y se mantiene a -20º C, siendo éste utilizado para realizar el estudio de la GS.

Para realizar el estudio de la GS primero tiene que purificar y se realiza a partir de un extracto crudo de E. coli que está transformado con un plasmado que lleva el gen glnA, por cromatografía de intercambio iónico; se realizan estudios para medir la actividad de la GS en las distintasfracciones obtenidas en la cromatografía y se calcula la actividad en la fracción purificada de mayor actividad, la cantidad de proteína; se estima los parámetros cinéticos de la enzima y se estudia la actividad fisiológica de la GS en Synechocystis PCC 6803.
















Purificación de la Glutamina Sintetasa

- Cromatografía de internambio iónico

Para la purificación de laenzima se utiliza 800 µl del estracto crudo 1 ml y el resto para la determinación de proteínas y de actividad GS.
Se prepara 100 ml HEPES 50 mM pH 7.0, partiendo de HEPES 1 M:
Ci.Vi = Cf.Vf
1000 mM. Vi = 50 mM. 100 ml
Vi = 5 ml
Hay que tomar 5 ml del tampon HEPES 1 M y añadir aguadestilada hasta los 100 ml, es decir 95 ml.
Se prepara 10 ml de una solución 50 mM KCl, 10 ml de una solución 100 mM KCl, 10 ml de una solución 200 mM KCl y 20 ml de una solución 400 mM KCl preparadas todas estas en HEPES 50 mM pH 7.
Ci.Vi = Cf.Vf
1000 mM. Ci = 50 mM. 10 ml
Vi = 0,5 ml
Parael caso de 10 ml 50 mM KCl se toma 0,5 ml de KCl 1 M y se enrasa hasta 10 ml con HEPES 50 mM pH7. Para los demás sería: 1ml, 2 ml y 8 ml de KCl 1 M respesctivamente.

La GS tiene muchísimas cargas negativas a pH fisiológico ( pH 7), por lo que se realiza una cromatografía de intercambio iónico:
Se coloca la matriz positiva dentro de la columna, siendo en este caso DEAE-Celulosa, que es unpolímero orgánico con sus cargas positivas.

Al añadir una parte del estracto crudo, las proteínas que sean positivas caen e igualmente con las neutras. Y todas las negativas van a sufrir fuerzas electrostáticas, siendo retraídas con mayor fuerza las mas negativas y con menor fuerza las menos negativas.
Para recuperar las proteínas que se encuentran en la matriz retraídas, se utiliza KCl, con...